陈燕桦，张炳东，何芳，周丽芳，韦祎，谢玉波

（广西医科大学第一附属医院，广西 南宁 530021）

右美托咪定是一种α2肾上腺素受体激动剂，广泛用于临床麻醉和重症监护室的镇静[1-2]。研究发现，右美托咪定可以减轻脑缺血再灌注损伤和体外循环相关的脑损伤，但其具体机制尚需进一步研究[3-4]。为此，本实验将右美托咪定用于大鼠体外循环中，观察大鼠海马CA1区神经元凋亡、脑组织含水量、血浆中IL-6和海马组织cleaved Caspase-3蛋白的表达，探讨右美托咪定在体外循环中的脑保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

健康雄性SD大鼠48只，体重250～350 g，采用随机数字表法，将其分为3组：假手术组（S组）、体外循环组（CPB组）和右美托咪定组（Dex组），每组16只。S组大鼠仅行动静脉穿刺置管术，不进行体外循环转流，120 min后结束实验；CPB组行体外循环转流120 min；Dex组在体外循环前泵注右美托咪定2.5μg/kg（江苏恒瑞医药股份有限公司），15 min给完，接着在体外循环转流过程中持续泵注右美托咪定2.5μg/（kg·h）直至体外循环转流结束。

1.2 大鼠体外循环模型的复制

腹腔注射1%戊巴比妥钠（北京普博斯生物科技有限公司）0.5 ml/100 g麻醉大鼠，仰卧位固定于实验台上，经口腔将16 G静脉留置导管（美国Arrow公司）插入气管，行机械通气，潮气量3 ml/100 g，频率60次/min，吸呼比为1.0∶1.5，实验中保持动脉血气二氧化碳分压维持在35～45 mmHg。颈前区、左右腹股沟处刮毛、消毒后纵向切开皮肤，右颈外静脉置入20 G静脉穿刺针（北京史密斯医疗器械有限公司）至右心房，依靠重力引流静脉血至贮血器（20 ml注射器，山东威高集团医用高分子制品股份有限公司）；右股静脉置入22 G静脉穿刺针行股静脉引流；左、右侧股动脉分别置入24 G静脉穿刺针，右侧股动脉行股动脉灌注，左侧股动脉用于监测动态血压和行血气分析。体外循环采用右股静脉、右颈外静脉–右股动脉转流。体外循环预充液：13 ml同种新鲜肝素化大鼠血液、5 ml乳酸林格液、5 ml 4%羟乙基淀粉溶液（重庆大新药业股份有限公司）。静脉给予肝素钠（上海上药第一生化药业有限公司）500 u/kg，待激活全血凝固时间（ACT）≥480 s后，使用Stockert Ⅲ型双头滚压泵（德国Stockert Ⅲ公司）和小动物膜肺（东莞科威公司）转流120 min。术中血气分析采用i-STAT1血气分析仪（美国ABBOTT公司），ACT监测采用ACT仪（美国Medtroniz公司）。体外循环期间维持血气分析数值在正常范围，红细胞压积约为25%，灌注流量维持在100～120 ml/（kg·min），平均动脉压维持在75～90 mmHg，鼻咽温度约36℃。体外循环转流120 min后实验结束。

1.3 ELISA法

每组随机选取8只大鼠在体外循环前（T0）、体外循环1 h（T1）、体外循环2 h（T2）时采集静脉血用于测定血浆IL-6浓度。静脉血标本1 000 r/min离心15 min，采集血浆上清液-20℃保存，最后采用ELISA试剂盒检测血浆IL-6浓度。

1.4 TUNEL检测

每组随机选取8只大鼠，实验结束后经升主动脉灌注生理盐水约100 ml至右心耳流出液体为无色，再灌注4℃、4%多聚甲醛（北京百奥莱博科技有限公司）约250 ml，至头颈部变僵硬。断头取脑，常规石蜡包埋后行连续冠状面切片，厚度4μm。按照TUNEL试剂盒（美国Roche公司）说明书步骤进行操作，经荧光染色（TUNEL、DAPI、Merge染色）后观察细胞凋亡情况。细胞质或细胞核中出现较亮的绿色颗粒为阳性细胞，即凋亡细胞。每张切片随机选取CA1区3个不同高倍视野（200倍），以平均密度比表示凋亡阳性细胞数，平均密度比=积分光密度/选定对象的面积，取3次平均值。

1.5 Western blotting检测

将剩余每组8只大鼠取新鲜海马组织，按照蛋白提取试剂盒说明书提取组织蛋白，用BCA法进行蛋白定量。取50μg蛋白加入上样缓冲液，蛋白变性后进行SDS-PAGE电泳。分离蛋白转移至PVDF膜，牛奶封闭2h，TBST洗膜后分别加入兔单克隆抗体cleaved Caspase-3（1∶1 000，美国Cell Signaling Technology公司）和兔抗ACTB多克隆抗体（1∶3 000，美国Bioworlde公司），4℃孵育过夜。TBST洗膜后加入红外标记的二抗（1∶10 000，美国Cell Signaling Technology公司），室温下避光孵育2 h，曝光成像。采用Odyssey双色红外激光成像系统扫膜，灰度值用Imaga J软件测定，以目的蛋白和内参β-actin蛋白灰度值比值表示cleaved Caspase-3蛋白的相对表达量。

1.6 脑组织含水量的测定

将每组8只大鼠去掉海马后的脑组织称湿重，置于55℃干燥箱内烘干24 h至恒重，称干重。计算脑含水量（%）=（湿重-干重）/湿重×100%。

1.7 统计学方法

数据分析采用SPSS 16.0统计学软件。计量资料以均数±标准差表示（±s），比较用单因素方差分析或重复测量设计的方差分析，两两比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠不同时间血浆IL-6浓度比较

CPB组、Dex组与 S组 T0、T1、T2的血浆 IL-6浓度比较，采用重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点的血浆IL-6浓度有差异（F=134.07，P=0.000）；②3组血浆IL-6浓度有差异（F=29.918，P=0.000），CPB 组较 S组高（P＜0.05），Dex组较CPB组低（P＜0.05）；③3组血浆IL-6浓度变化趋势有差异（F=21.638，P=0.000）。见表1和图1。

表1 各组大鼠不同时间血浆IL-6浓度比较（n =8，pg/ml，±s）

表1 各组大鼠不同时间血浆IL-6浓度比较（n =8，pg/ml，±s）

注：1）与 S组比较，P ＜0.05；2）与 T0比较，P ＜0.05；3）与CPB组比较，P ＜0.05

组别 T0 T1 T2 S 组 9.42±0.62 10.93±1.59 11.13±1.41 CPB 组 9.95±1.18 17.76±2.771）2） 19.37±2.401）2）Dex 组 9.91±1.67 16. 57±1.191）2） 15.22±1.822）3）

图1 各组大鼠血浆IL-6浓度的变化趋势 （n =8）

2.2 各组大鼠海马CA1区凋亡阳性细胞和脑组织含水量比较

免疫荧光染色后，可见凋亡细胞质或细胞核中出现较亮的绿色颗粒，正常细胞核呈蓝色。大鼠海马CA1区的TUNEL染色图片中，S组和Dex组可见少量散在绿色颗粒，而CPB组可见较多绿色颗粒（见图2）。CPB组、Dex组、S组大鼠CA1区的凋亡阳性细胞数比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=96.732，P=0.000）；进一步两两比较经LSD-t检验，CPB组较S组凋亡阳性细胞多（P＜0.05）；Dex组较CPB 组少（P＜0.05）（见表2）。

CPB组、Dex组、S组脑组织含水量比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=5.431，P=0.013）；进一步两两比较经LSD-t检验，CPB组高于S组（P＜0.05）；Dex组低于CPB组（P＜0.05）。见表2。

2.3 各组大鼠海马CA1区cleaved Caspase-3蛋白表达水平比较

各组大鼠海马CA1区cleaved Caspase-3蛋白在17 kD左右出现特异性条带（见图3）。CPB组、Dex组、S组海马组织cleaved Caspase-3蛋白相对表达量分别为（0.89±0.03）、（0.63±0.06）和（0.60±0.06），经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=76.244，P=0.000）；进一步两两比较经LSD-t检验，CPB组高于 S组（P＜0.05）；Dex组低于CPB组（P＜0.05）。

图2 各组大鼠海马CA1区的凋亡阳性细胞 （荧光染色×200）

表2 各组大鼠CA1区凋亡阳性细胞和脑组织含水量比较（n =8，±s）

表2 各组大鼠CA1区凋亡阳性细胞和脑组织含水量比较（n =8，±s）

注：1）与S组比较，P ＜0.05；2）与CPB组比较，P ＜0.05

组别 凋亡阳性细胞（个/mm2） 脑组织含水量/%S组 2.23±0.74 77.07±1.55 CPB组 8.97±1.271） 79.65±1.621）Dex组 5.98±0.812） 77.49±1.862）F值 96.732 5.431 P值 0.000 0.013

图3 各组大鼠海马组织cleaved Caspase-3蛋白的表达

3 讨论

体外循环是一种非生理状态，血液与体外循环管道等接触时可以产生大量炎症因子，激活补体，引起全身炎症反应，导致全身组织器官损害[5-6]。体外循环心脏外科手术后出现认知功能障碍和脑损伤等[7]，会延长患者术后恢复时间，增加患者住院日，增加病死率和医疗费用等，因此减轻体外循环相关的脑损伤非常迫切。

研究表明，右美托咪定对脑缺血再灌注损伤具有保护作用，其机制可能与右美托咪定减少氧化应激和炎症反应有关[8-9]。IL-6是一个重要的促炎因子，可以激活细胞内信号传导通路[10]。Caspase-3是与凋亡相关的一种调解蛋白[11]，其激活可以诱导细胞凋亡增多，所以细胞凋亡增加时，可发现cleaved Caspase-3表达增多[12]。

本研究结果显示，体外循环可以引起大鼠脑组织水肿加重和海马神经元凋亡增多，并且促进IL-6和凋亡相关蛋白cleaved Caspase-3的表达；使用右美托咪定可以减轻体外循环导致的大鼠脑组织水肿和减少大鼠海马神经元细胞凋亡，下调炎症因子IL-6和凋亡相关蛋白cleaved Caspase-3的表达，说明右美托咪定对大鼠体外循环有脑保护作用。

综上所述，体外循环可以诱导大鼠海马神经元凋亡增多，而右美托咪定可以减轻大鼠体外循环相关的脑损伤，其机制可能与其减轻体外循环相关的炎症反应，下调cleaved Caspase-3蛋白表达有关。