李秀锋， 范蓓媛， 刘力行， 王军波， 陈德勇， 陈 健

(1.中国科学院电子学研究所 传感技术国家重点实验室，北京 100190；2.中国科学院大学，北京 100039)

0 引 言

细胞内的蛋白质是否表达及表达量的差异，由基因和外界环境共同调控，影响着疾病的发生、机体的衰老、神经的传导等，是生命活动变化的关键指标[1]。因此，蛋白质的定量检测技术，对细胞生物学分子机制研究、疾病临床诊治和药物开发等至关重要[2,3]。

传统的细胞蛋白质定量检测方法如凝胶电泳、免疫分析、质谱等技术，大多是针对群体细胞采集数据，检测结果反映了蛋白平均表达水平。然而，生命体内甚至遗传物质相同的细胞之间都存在差异(即异质性)[4,5]，在细胞群体水平上的研究结果可能会忽略这种差异，致使某些重要的分子机制被隐藏起来[6]。这意味着在单细胞水平测得的数据更能够精确地反映生命事件的真实情况，单细胞蛋白定量检测技术对于深入理解生命活动过程具有重要意义[7]。

除此之外，单细胞蛋白定量检测技术对于珍贵样本、稀有细胞的分析也具有重要意义。例如，对循环肿瘤细胞(circulating cumor cell,CTC)的蛋白定量检测能够直接得到肿瘤细胞的表型信息，有助于病情判断和药物研发[8]，然而每7.5 mL血液中仅有1～500个CTC，数量极其有限，传统的针对宏观大量细胞分析的技术存在处理损失等问题，不能充分有效地利用这些珍稀样本，只有单细胞蛋白定量检测技术才能更高效地对稀有细胞进行多种蛋白的同步多重测定[9]。

近年来各种不同的单细胞蛋白定量检测方法不断涌现，既有基于传统技术不断加以改进的方法，也有基于微流控芯片的新技术。本文将就不同方法的原理、主要特点和优缺点分别阐述。

1 传统的单细胞蛋白定量检测方法

1.1 荧光流式细胞术

荧光流式细胞术(florescence flow cytometry，FFC)是目前最主要的单细胞蛋白检测方法。在对细胞蛋白分析时，首先将分散的单细胞用带荧光的特异性抗体标记后在流体聚焦作用一次通过检测区域，含有荧光标记的细胞被激发出荧光，可通过平均荧光强度来反映蛋白的相对含量[10,11]。FFC的一个重要优势是保持了细胞完整性，从而使细胞内绝对含量极少的蛋白质保持较高的浓度，提高灵敏度。此外，它具有高通量检测能力，每秒能够测定1×103～5×104个细胞。目前流式细胞术在结合了单克隆抗体技术、新的荧光探针(量子点等)和多通道检测技术后分析参数多达10～17种[12,13]，从而允许在单个细胞中分析整个信号通路，已成为单细胞蛋白检测的金标准[18]，应用于细胞膜和细胞内蛋白的检测，比如通过检测细胞膜表面的CD系列分化抗原判断相应免疫细胞的比例对白血病分型，已经是国际公认方法[14,15]。

荧光流式细胞术对单细胞内部蛋白检测时，在亮度标定时也必须使用可以等效的内部修饰有荧光分子的标准微球与之比较荧光亮度，但是这种定量修饰技术目前并不成熟，因此流式细胞术无法用于单细胞内蛋白的绝对定量检测；同时由于样品前处理需要大量单细胞，因此不适用于样本量缺乏情况下的蛋白检测[16]。

1.2 质谱流式细胞术

质谱流式细胞术(mass cytometry)，是流式细胞技术与质谱技术的结合。首先采用重金属元素标记细胞中特定蛋白，然后形成单细胞液流，经雾化后在氩等离子体中单细胞形成离子云团，在去除基体离子的干扰后利用飞行时间质谱仪检测标记元素的质量谱，最后将原子质量谱的数据转换为单个细胞待测蛋白相对含量[17]。

质谱流式细胞术最重要的特点是由于使用了稀土元素标记，避免了荧光流式细胞术中的通道间串扰，并降低了背景，因而能够同时获取多达40个单细胞参数[12]。但是由于细胞的电离及后续的质谱检测过程需要一定时间，质谱流式细胞术的检测速度低于普通荧光流式细胞术，一般在500个细胞/s左右，并且细胞在电离分析后无法再次利用。

在质谱流式细胞术中，将组织分散成单细胞后再进样，需要复杂、长时间的样品处理时间，因而检测结果可能产生偏移。一种改进方法是成像质谱术(imaging mass cytometry，IMC)[18]。在IMC中，将固定在载玻片上的组织切片或细胞标记上金属同位素后，直接用高功率激光局部照射并扫描，被照射处样品蒸发进入质谱仪中，这样可快速获得样品的二维质谱图像，经处理后反映出样品的蛋白含量分布情况。

1.3 酶联免疫斑点检测

酶联免疫斑点检测(ELISpot)是一种检测单细胞外分泌蛋白的技术。它利用底面修饰有特异性抗体的微孔板培养细胞并施加特定刺激，细胞的外分泌蛋白被抗体捕获，再经过显色反应，即可在细胞位置处呈现出斑点，斑点的数目反映了分泌该蛋白的细胞数目，由此可对相应的单细胞比例进行评估[19,20]。

酶联免疫斑点法灵敏度极高，106个细胞里只要有55个细胞分泌特定蛋白即可判定结果为阳性[21]。该方法被广泛地应用于免疫反应的研究中，比如DiPiazza等人[22]用ELISpot技术表征雪貂在感染流感病毒后关键淋巴组织内的白细胞组成和抗原特异性T细胞响应情况，发现CD4和CD8 T细胞对多个病毒变种都有较强的免疫特性。该方法不能对单个细胞中的蛋白分泌量进一步分析，因此是一种准单细胞检测技术[3]。

1.4 毛细管电泳

毛细管电泳(capillary electrophoresis)是利用高压直流电场(0～30 kV)对毛细管(直径小于100 μm)内样品分离并检测的技术[23,24]。首先利用电迁移、压力等技术将单细胞移入毛细管，在样品区采用化学、激光、电脉冲等方法裂解，在高压电场作用下不同分子所带电荷和体积大小的差异导致迁移速率的不同，因而到达检测区域的时间也不同，检测时与电化学、激光诱导荧光(laser-induced fluorescence,LIF)、质谱等技术联用，探测器输出待测分子数按到达时间分布的电泳谱图，利用峰的高度或面积可进行绝对定量或半定量分析。

毛细管电泳利用毛细管和电泳技术具备了单细胞操纵和蛋白分离能力，具有高灵敏度、超低进样量、多组分分析的特点。但是受限于进样方式，毛细管电泳很难实现对大量单细胞的快速检测[25]。

2 基于微流控技术的单细胞蛋白定量检测方法

微流控技术由于特征尺寸与细胞大小相匹配，在单细胞的操纵与特性检测方面具有明显优势。因此将单细胞蛋白检测与微流控技术结合，利用芯片上的微通道使细胞悬浮液在流体驱动下分散成单细胞，再综合片上培养、裂解、电泳、免疫反应等技术实现待测蛋白的提取与纯化，最后基于免疫荧光、原子力显微镜、质谱等技术实现对单细胞内蛋白表达量的分析[26,27]。

微流控芯片结构的不同使得可检测蛋白种类、检测通量、灵敏度也有所差异，下面分类阐述基于微流控技术的单细胞蛋白分析方法。

2.1 片上流式法

片上流式法是利用微流控技术在芯片上实现传统流式细胞仪而对单细胞蛋白分析的一种方法。与传统的流式细胞术相比，片上流式法的优势在于对少量样品(数百至数千个)比如稀有细胞的检测，对细胞个数需求从104减少到102个。但是与常规流式细胞术问题相似，微型流式细胞术同样因标定方法限制而无法绝对定量检测细胞内蛋白[28]。

2.2 微孔阵列法

微孔阵列法是一种利用片上微孔被动捕获单细胞后培养并检测的技术[41]。其原理是利用微加工技术制作出比单细胞尺寸略大的微孔阵列，然后滴上低浓度的单细胞悬浮液，微孔中将以一定概率落入单细胞，再覆盖上表面修饰有特异性抗体的玻璃板并培养，细胞的特定分泌蛋白被抗体捕获，从而实现单细胞蛋白检测[29]。Love J C等人[30]在聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS)表面利用软光刻法加工出20～50 μm的微孔，利用上述方法检测到微孔中低至0.1 mol/L的免疫球蛋白。该方法能够一次检测多种蛋白，并可对细胞再回收。但它只能检测分泌蛋白，同时受限于芯片尺寸和单细胞形成率，一次实验只能获得低于3 000～10 000个细胞的数据，因此检测通量较低。

2.3 微沟道阵列法

微沟道阵列法，也称为单细胞条码芯片。芯片上的微通道底部按空间位置不同修饰有相应捕获抗体，形成一个个“编码”条带，细胞悬浮液从芯片一端注入检测通道后，通过片上集成微阀将细胞分隔到数千个腔室中形成单细胞，该方法不仅可以检测细胞外分泌蛋白，还可以从其他通道注入裂解液，裂解细胞，提取单细胞内目标蛋白，进行定量分析[31]。Ma C等人[32]利用该方法实现了同时定量测定多达20种蛋白，灵敏度为100～1 000个蛋白分子，并应用于血液检测中。该方法可以绝对定量检测单细胞特定蛋白，但是由于芯片上集成了多种结构，操作复杂，也限制了检测通量。

2.4 单细胞蛋白印迹法

单细胞蛋白印迹法扩展了传统的Western Blot方法的应用范围。首先利用软光刻法在光敏胶(polyacrylamide gel)上加工微孔，利用稀溶液得到单细胞后，在孔内原位裂解，再直接进行片上凝胶电泳，将不同分子量的蛋白分离，可对12种蛋白同时分析[33]。Sinkala E等人[9]利用该方法实现了乳腺癌CTC的筛查并对CTC之间蛋白标志物的差异进行了分析。目前利用该技术已经实现了一种商业化的单细胞分析仪器MiloTM，一次能对1 000～2 000个单细胞的4种蛋白检测。但是这种方法通过比较颜色深浅来判断待测蛋白的相对含量，无法获得蛋白的绝对定量结果。

3 结 论

单细胞水平的蛋白质定量检测结果能够揭示出细胞之间的差异，更精细地反映生命事件的发生过程，实现细胞群体中的单个或稀有细胞蛋白质数量差异的快速鉴别和发现，从而对生命现象本质的解释、人类的健康起到促进作用。面向单细胞的蛋白定量检测需求越来越多，但是也充满着挑战。原因一方面在于细胞尺寸小(一般哺乳动物的体细胞直径约为10～20 μm)，给大量单细胞的获取和处理带来了极大的困难；另一方面在于细胞组分复杂，单个细胞内物质含量极低，检测时基质干扰较大[33]。因此,理想的单细胞蛋白检测方法应具备高灵敏度、高选择性、高通量、能绝对定量特点。

目前，单细胞蛋白定量检测技术仍然处于探索、发展阶段，虽然已经初步实现了单细胞蛋白定量检测，但在检测范围、检测实时性、绝对定量等方面仍有很大的提升空间，将来必定向着多参数、高特异性、高准确度、可实时性的方向发展，并最终应用于临床，造福人类。