於孝牛 高燕

摘要：微生物矿化是基于微生物诱导矿化形成无机矿物。微生物矿化形成碳酸钙可以作为一类新型胶凝材料，并且可以固结松散的砂土颗粒，在地基加固、扬尘治理等领域具有广泛应用前景。本文主要概述了研究生物矿化方法和微生物碳酸水泥潜在应用砂土加固、水泥基材料裂缝自修复等，详细讨论分析了Bacillus pasteurii中脲酶水解尿素机理，并指出脲酶水解尿素存在水解和消除竞争。当今研究微生物水泥也存在各个步骤的反应机理、产物晶型的影响机制、复合微生物对矿化晶形如何影响等问题，通过研讨展望指出进一步研究微生物水泥方案。

关键词：微生物矿化；胶凝材料；砂土颗粒；研讨；脲酶水解尿素机理

中图分类号：G642.0 文献标志码：A 文章编号：1674-9324（2019）09-0173-05

一、背景

生物矿化研究最早始于20世纪二三十年代的欧洲，此后欧美等国家不断发展新的微观检测技术，为系统深入研究生物矿化提供了可靠的技术手段。直到20世纪80年代我国著名化学家王夔院士和材料学家李恒德院士将生物矿化的概念介绍到国内，此后中国的生物矿化研究开始逐渐形成规模[1-3]。其中很重要的一个方面就是在学习矿化材料合成方法的基础上，研究并实施新的材料制备策略，而深入进行这些工作的一个重要前提就是表征天然生物礦物的分级结构及探索生物矿化的基本机理[3，4]。

生物界中有各种各样的生物矿化材料，这些材料由生命系统参与合成的天然的生物无机材料和生物高分子复合材料组成，例如珍珠、贝壳、骨骼和牙齿

等[3]。这些复合材料相比于普通化学方法合成的复合材料有着优异的机械性能。例如鲍鱼壳，它掺有一定比例的有机成分的碳酸钙晶体复合材料，其壳珍珠层的断裂功高达1200J/m2，高于普通文石2—3个数量

级[5]，如图1所示。这种不同寻常的性能来源于在特定生物条件下，材料的巧妙组装过程及其所具有的精细微观结构，这便是生物矿化的魅力所在。

生物可以随心所欲地制造各种微观和宏观结构的矿物材料，并且是在完全环保的条件下（可以称其为绿色制造），若能完全破译这种制造方法的原理，人类就可以通过模仿来制造所需要的材料，其意义是巨大的。

二、微生物矿化材料的研究现状

近些年来，国内外在矿化材料方面的研究如火如荼，尤其是东南大学的钱春香教授利用微生物矿化在石英砂胶结、混凝土裂缝自修复和修复土壤重金属方面做了大量研究，而清华大学的冯庆玲教授等对仿生物矿化的方面也做了较为深入的研究，此外还有崔福斋、欧阳健明、睿康、张天蓝和王爱华等对仿生物矿化也做了较为深入的研究，他们共同带动了国内对生物矿化研究的热潮。

钱春香等[6]研究微生物矿化沉积碳酸钙的产率，研究结果表明：底物浓度对碳酸钙沉积量和单位体积产率的影响最大，如表1所示。该作者进一步研究了自修复混凝土中微生物矿化方解石的形成机理，主要从四个方面（矿化产物、pH值、O2、底物）研究用于混凝土裂缝自修复的微生物矿化形成方解石机理[7]。研究结果显示，细菌生长繁殖过程中创造碱性环境，产生CO2，细菌细胞表面带负电荷，能够吸附Ca2+并作为成核位点，在碱性环境下CO2与Ca2+反应形成CaCO3晶体。

刘旭杰等[8]研究不同化学官能团具有代表性的化学官能团（羟基、氨基、羧基和甲基等）对无机相碳酸钙晶体的调控，模拟碳酸钙体外矿化实验，根据拉曼光谱（Raman）确定了碳酸钙的晶型，结果表明，羟基和甲基对碳酸钙的晶型选择无明显影响，氨基和羧基能通过对碳酸根离子或钙离子的吸附而诱导球文石结晶。

成亮等[9]研究碳酸盐矿化菌修复土壤重金属镉，结果表明能够有效修复土壤重金属Cd2+的污染，并且矿化形成稳定的碳酸镉化合物，同时也研究了体系、细菌体体系、细菌分泌物液体系对碳酸钙结晶动力学，晶体形貌影响和碳酸盐矿化菌液中的不同成分对碳酸钙晶体形成机理进行了研究，研究发现生物有机质分子链的极性基团（COOH等）与Ca2+产生静电、配位等一系列作用，调控晶体的生长[10，11]。

竹文坤等[12]研究利用巴斯德芽孢杆菌繁殖过程产生的酶化作用，适时引入Ba2+，形成碳酸钡沉淀并对样品形貌、结构、热性质等进行表征。结果表明，巴斯德芽孢杆菌诱导沉淀的碳酸钡与纯水中的不同，含有少量有机物质，晶形转变温度降低，主要为花簇状和放射状，属于正交晶系。菌体和代谢物在碳酸钡晶体成核、生长及堆积过程中扮演重要的角色。

Li M等[13]从土壤中分离产脲酶菌株能够水解尿素，由于此反应的发生导致土壤pH升高和碳酸根生成，这会导致在可溶性镍、铜、铅、钴、锌和镉等重金属离子溶解在含水土壤中矿化，并且它们最终转化为稳定的碳酸盐。培养48小时后，选择菌株表现出较高的重金属去除率，范围在88%—99%之间。扫描电子显微镜和X-射线衍射分析表明，pH等于8—9时，生物积累的重金属离子沉积包裹在细胞周围，碳酸盐矿物为菱形、球形、针状晶体。通过这个研究可以看出，土著微生物能够生存在有毒的土壤和废水中，并且封存可溶性重金属生成生物矿物，在重金属修复方面起着重要作用。

在国外，许多研究者主要研究微生物矿化在混凝土裂缝自修复、胶结石英砂子和重金属处理方面的应用，例如Wiktor V等[14]关于研究关键是裂纹形成后的双组分组成的细菌孢子和乳酸钙的生物化学剂从颗粒释放由裂纹进入水中。随后的微生物诱导形成的碳酸钙将裂缝完全填充，如图2所示。Wang N J Y等[15]利用硅藻土作为微生物保护媒介研究混凝土自愈合，研究的主要目标是应用微生物沉淀CaCO3愈合混凝土中的裂缝，因为微生物碳酸钙与水泥基材有更好的兼容性和相对于通常使用聚合物材料更好的环境。荷兰代尔伏特理工大学的Whiffin V S等利用微生物矿化产生碳酸钙（方解石）胶结砂柱[16]。Sarda D等[17]利用营养肉汤和脑心浸液作媒介研究微生物矿化产生碳酸钙改善砖块的吸水性能，由于水的存在，大部分砖结构发生了严重变化，沉积方解石覆盖在砖块表面空隙并大幅降低砖块的吸水率。通过减少水的吸收可提高砖块的耐久性。Stocks-Fischer S等[18]在不同条件下研究微生物诱导碳酸钙并讨论沉淀的因素。

三、脲酶水解尿素的机理研讨

微生物引起矿物沉积是因为潮湿环境里的新陈代谢生成脲酶（Urease），尿素酶水解尿素生成氨气和二氧化碳，然后二氧化碳溶于微生物溶液形成碳酸根，再与周围溶液中的钙离子反应生成具有胶凝性质的碳酸钙沉淀。微生物的作用不仅仅是生成脲酶，而且为碳酸钙的沉积提供了成核地点。微生物引起了矿物沉积过程中所发生的复杂的化学反应。在此方面Benini S和Ciurli S等[19-22]研究了抑制剂阻止Bacillus pasteurii中脲酶水解尿素，由图3可知尿素的自然分解大约为3.6年，而在尿素催化下水解大约为1微秒，约是自然分解速率的1014倍[23]。作者通过分辨率为2.0埃的低温同步辐射X射线晶体衍射得到了原始脲酶和抑制剂配位的脲酶结构。通过Bacillus pasteurii脲酶抑制剂的设计，需要从分子水平上知道脲酶分解尿素机理，作者提出了可能发生的脲酶水解尿素生成氨气和二氧化碳的机理，如图4所示。

Barrios A M等[24]研究通过溶剂挥发法和蒸汽扩散法模拟合成[Ni2（μ-OH）（μ-H2O）（bdptz）（urea）2]（ClO4）3，[Ni2（μ-OH）（μ-urea）（bdptz）（urea）（CH3CN）]（ClO4）3，[Ni2（μ-OH）（μ-H2O）（bdptz）（μ-OCN）]2（OTs）4）三种不同配位形式的类脲酶催化水解尿素。[Ni2（μ-OH）（μ-H2O）（bdptz）（urea）2]（ClO4）3在两步反应中，加热影响尿素的水解。在第一步中，消除一分子氨并伴随产生氰酸，在这一阶段乙腈中速率常数是（7.7±0.5）×10-4h-1，在同样的条件下，这个反应比自发分解尿素至少快500倍。当含氰酸酯的产物在水中进一步加热，氰酸水解的二阶速率速率常数是（9.5±1）×10-4h-1。[Ni2（μ-OH）（μ-H2O）（bdptz）（urea）2]（ClO4）3在50%乙腈水溶液中反应得到氨伴随着没有明显含氰酸酯产物的积累。一种可能类似含氰酸酯的产物[Ni2（μ-OH）（μ-H2O）（bdptz）（μ-OCN）]2（OTs）4。这些结果确立优先通过一种氰酸酯中间体水解尿素，作为一种替代脲酶催化水解尿素机理。

Suárez D等[25]通过量子化学计算研究双镍配合物关于脲酶催化水解尿素的机理。作者通过B3LYP密度泛函来表征平衡几何、电子、磁性质和一系列能量特征，实现脲酶活性部位的配合物建模，为理论分析结果提供了新的洞察结构——底物结合和催化机理。在水桥联两个镍离子之间观察到在脲酶晶体结构中被分配到羟基桥联在与所观察到的小反铁磁耦合。在表征单齿和双齿结合尿素配合物中，这里的尿素有很好的催化方向。最后，作者开始调查研究单齿和双齿结合尿素配合物的各自反应机理。在这两个机理当中，桥联Ni1—Ni2的羟基和Ni2配位的水分子起着至关重要的作用，如图5所示。

Estiu G等[26]进一步研究显示，在脲酶催化尿素分解中可能存在消除和水解途径竞争。他们采用计算的方法分析了一系列的中间结构和过渡态的平衡几何、电子特性和能量。他们从比较不同的可能反应机理中预测到一分子水参与反应，先是尿素酰胺氮质子化，随后释放一分子NH3。这个水分子类似于一个在脲酶活性位点上的重要残留物（例如His320），并且与尿素氮酰胺形成氢键作用。在脲酶和酞嗪体系分子内与分子间氢键键合强度增强，通过增加酰胺氢原子的酸度，触发尿素和带正电荷的Ni离子配位。尿素配位模式，实验观察酞嗪配合物和理论再现显示氢键链接酰胺氮和橋联OH。分子动力学模拟脲酶—尿素体系和定义第一步催化消除机理，氰酸水解后产生氨基甲酸，这个在第一阶段形成。根据分子动力学初步模拟结果，这两步机理可能发生在酞嗪模型体系中和在脲酶活化位点上。

四、研讨微生物矿化存在的问题

通过对国内外微生物矿化形成碳酸盐矿物的研究现状分析，可以看出微生物矿化材料与其他传统材料相比有着明显的优势，如对环境污染小、修复混凝土裂缝和胶结砂土等前后透水性能变化较大、材料性能得到提高、经济性强等，但仍存在以下几方面的问题：（1）至今各国科学家没有完全掌握微生物矿化碳酸盐矿物各个步骤的反应机理，尤其是对Bacillus pasteurii水解尿素机理方面的研究，由于脲酶催化分解尿素的分解速率是自然分解速率的1014倍且在1μs完成反应，现在检测技术很难达到能够检测任何步骤的反应物，所以无法准确掌握各步骤的反应产物，如反应中间体的准确测定和表征。（2）微生物分泌物对矿化产物晶型的影响机制，与仿生矿化的晶型对比。什么物质主要控制什么样的晶型。（3）微生物矿化产物的性能与化学方法或仿生矿化对比，例如热稳定性和粒径分布等。（4）微生物矿化材料晶型（方解石和文石等）通常是用XRD和ESEM确定晶型，是否可以用其他表征方法确定，如拉曼方法等。（5）通常研究单一微生物对矿化晶形和该微生物分泌液和菌体对晶形的影响，复合微生物对矿化晶形如何影响，其他微生物分泌液和菌体对晶形如何影响，复合微生物分泌液和菌体对晶形如何影响，等等。

五、研讨展望

1.脲酶催化分解尿素研讨展望。研究微生物脲酶催化分解尿素机理，通过氧标同位素标记溶剂来判断反应中18O在形成碳酸根中脲酶中是否有交换来大致推导反应机理，对同位素标记化合物需要测定反应前后的丰度比，测定脲酶反应前后的丰度比和尿素、碳酸钡中16O/18O的丰度比，再通过脲酶和抑制剂硫脲生长晶体来进一步推导脲酶催化分解尿素机理。

2.展望系统研究微生物矿化与在不同条件下矿化形貌和性能对比。通过本阶段可以进一步了解微生物矿化产生不同晶形的原理，在不同矿化环境下对晶形的影响可能各不相同。通过改变碳酸盐矿物晶体生长的周边环境，即复合菌体与分泌物和非碳酸盐矿化菌及其菌体与分泌物在碳酸盐矿物晶体生长过程中不同的作用情况，结合动力学参数的改变，通过热稳定性、纳米压痕技术研究矿化产物微观力学性能、粒径分布、XRD等测试手段，观察结晶过程中，晶体与外界环境的作用情况以及对最终形态的影响。以结晶结构学为理论基础，通过对晶体晶面生长的研究，推论出菌体及分泌物对晶面的作用情况，从而解释最终形貌的形成原因。

3.展望菌體与分泌物对碳酸盐矿化产物晶体生长的动力学影响。通过溶液电导率等测试手段研究碳酸盐矿化产物的晶体在不同体系环境中结晶动力学的过程，并以此来研究各体系在碳酸钙结晶过程中所产生的影响。

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