袁乐梅，边名鸿，李正涛，杨志阳，张雨

(1.四川理工学院 生物工程学院，四川 自贡 643000；2.酿酒生物技术及应用四川省重点实验室，四川 自贡 643000)

酸菜是我国人民喜爱的传统蔬菜发酵制品，其口味多样、味道酸爽、开胃醒酒，不仅能帮助消化、增进食欲，还具有降低胆固醇和抗癌等功效[1]。酸菜汁液中含有多种功能性微生物，赋予了酸菜多种口感、营养和香气[2]。不同地区的酸菜口味风格相差较大，川西彝族传统酸菜是在海拔1800 m的高寒地区制作出的特色酸菜，最终成菜是干酸菜，需煮食[3]。川西彝族传统酸菜以圆根菜为主要原料，泡制过程中不添加盐，避免了细胞因渗透压过高而失水，发酵过程中也几乎不产生亚硝酸盐。由于其特殊的地理环境和独特的制作工艺，形成了川西彝族传统酸菜独特的口感和香气，同时其酸菜母汁中也富集了彝族高山地区特有的菌群，对其进行深入的研究并且应用于蔬菜发酵中，对提高人们的健康水平和开发新的发酵蔬菜品种有着重要的意义[4]。

川西彝族传统酸菜制作过程独特，在没有盐胁迫的环境中乳酸菌仍富集为优势菌，说明该菌群的繁殖能力及抑菌能力都较强。本研究拟从川西彝族传统酸菜汁中筛选抑菌性较强的乳酸菌，并对筛选得到的菌种进行鉴定及特性研究，以期将川西彝族传统酸菜汁中的功能性微生物应用于低盐发酵蔬菜制品生产，为低盐蔬菜发酵提供一定的菌种资源和数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料

样品：川西彝族传统酸菜汁，采自川西传统彝族家庭。

试验菌株：大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，由酿酒生物技术及应用四川省重点实验室提供。

1.2 试剂与培养基

PCR引物、Taq酶、10×缓冲液、dNTP：宝生物工程(大连)有限公司；琼脂糖：北京索莱宝科技有限公司；Marker：上海英骏生物技术有限公司；其他试剂：均为分析纯，购于成都市科龙化工试剂厂。

MRS分离培养基[5]：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母膏5 g，葡萄糖20 g，柠檬酸氢二铵2 g，磷酸氢二钾2 g，硫酸镁0.58 g，硫酸锰0.25 g，乙酸钠5 g，吐温-80 1 mL，碳酸钙20 g，琼脂20 g，加水定容至1000 mL，pH 6.2±0.2，灭菌待用。

营养琼脂培养基[6]：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化钠5 g，琼脂20 g，加水定容至1000 mL，pH 7.5左右，灭菌待用。

1.3 仪器与设备

PHS-2C精密pH计 上海虹益仪器仪表有限公司；WH-2微型旋涡混合仪 上海泸西分析仪器厂有限公司；生化培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；756紫外可见分光光度计 上海奥谱勒仪器有限公司；DYY-12电泳仪 北京百晶生物技术有限公司；PCR仪和凝胶成像系统 美国Thermo公司。

1.4 试验方法

1.4.1 产酸乳酸菌的分离纯化

吸取1 mL彝族传统酸菜汁，用无菌水将其进行逐级稀释，制备10-1～10-99个梯度稀释液。吸取各梯度的菌悬液200 μL涂布于MRS分离培养基上，于37 ℃恒温培养24～48 h。挑取具有较大溶钙圈的菌落，再在MRS分离培养基上划线培养，按溶钙圈大小分类并做好标记[7]。

1.4.2 复筛

将溶钙圈大的乳酸菌以2%的接种量，分别接种到含有MRS液体培养基的离心管中，置于摇床中，37 ℃下培养24 h，12000 r/min离心8 min，取上清液备用。以生理盐水代替待检上清液为对照组，用牛津杯双层平板扩散法测定对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果[8,9]。量取抑菌圈直径，根据抑菌圈直径大小进行复筛。

1.4.3 生长曲线和产酸特性分析[10]

以2%的接种量将复筛的乳酸菌接种于100 mL的MRS液体培养基中，于37 ℃生化箱中培养24 h，每隔2 h吸取菌液在600 nm处测定吸光值和pH值。以培养时间为横坐标，以A600为纵坐标绘制生长曲线图；以pH值为纵坐标绘制产酸能力曲线图。

1.4.4 耐受性实验

1.4.4.1 温度耐受性

以2%的接种量将菌液接种于含有10 mL MRS液体培养基的试管中，分别于温度25，27，29，31，33，35，37，39 ℃下培养24 h，每4 h在600 nm处测定吸光值，每组3个平行[11]。

1.4.4.2 pH耐受性

以2%的接种量将菌液接种于pH分别为2，3，4，5，6的含10 mL MRS液体培养基的试管中，于37 ℃生化培养箱中培养24 h，分别在600 nm处测定吸光值，各pH下的菌株做3组平行[12]。

1.4.4.3 盐度耐受性

以2%的接种量将菌液接种于NaCl质量浓度分别为0，4%，8%，12%，16%，20%，24%的含10 mL MRS液体培养基的试管中，于37 ℃生化培养箱中培养24 h，每隔4 h分别在600 nm处测定吸光值，各NaCl质量浓度下的菌株做3组平行[13,14]。

1.4.5 乳酸菌16S rDNA分子生物学鉴定[15]

PCR引物的上游序列为27F：5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'，下游序列为1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。

PCR反应体系(50 μL):10×缓冲液5 μL，dNTP 3 μL，引物27F和1492R各1 μL，Taq酶1 μL，模板3 μL，DDW 36 μL。

PCR扩增程序：95 ℃预变性4 min，95 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，30个循环后，72 ℃保留10 min；于10 ℃保存。

PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，于凝胶成像系统下观察，可见约1500 bp条带，送至上海生物生工测序有限公司成都分部进行测序，将测序结果输入NCBI，利用数据库中的BLAST功能与已有的细菌16S rRNA基因序列进行对比，选择与测定菌株同源性高的已知菌种，利用Clustalx和MEGA等软件，绘制系统进化树。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌的分离和筛选

菌株的产酸量高低与溶钙圈大小成正比，由此分离纯化出41株产酸明显的乳酸菌，接种于MRS液体培养基中发酵后取上清液，用牛津杯双层平板扩散法测定其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌能力。发现6株菌株上清液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用，其抑菌圈均大于17 mm，见表1。

表1 6株菌对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌情况Table 1 6 strains' inhibition on E.coli and Staphylococcus aureus mm

2.2 形态特征

将具有较强抑菌能力的6株乳酸菌进行形态学的初步鉴定[16]。各菌株的菌落和菌体形态特征见表2和图1。

表2 乳酸菌的形态学特征Table 2 The morphologic characteristics of Lactobacillus

图1 部分菌株的菌落形态和显微形态Fig.1 Colony and microscopic morphology of part strains

由表2和图1可知，6株菌株菌落形态大致相同，菌落呈白色或乳白色，圆形，中央凸起，表面光滑湿润，边缘整齐；菌体形态呈短杆状或球状，无芽孢和鞭毛，单个或呈链状，革兰氏染色均呈阳性。

2.3 生长曲线及产酸特性分析

图2 6株乳酸菌的生长曲线Fig.2 Growth curves of 6 strains of Lactobacillus

图3 6株乳酸菌的产酸特性分析曲线Fig.3 The curves of acid production characteristics of 6 strains of Lactobacillus

由图2和图3可知，乳酸菌B1和B3具有类似的生长曲线，培养4 h后菌体大量繁殖，进入对数生长期，14 h时菌体量达到最大，进入稳定期；乳酸菌A1和F1在培养2 h后进入对数期，14 h时进入稳定期；乳酸菌C3在培养8 h左右时进入对数期，14 h时进入稳定期；乳酸菌D2在培养14 h后菌体进入对数期，20 h后进入稳定期。乳酸菌C3、D2和F1生长过程中pH值无较大变化；乳酸菌A1、B1和B3的pH值随时间增加逐渐减小。pH值越低说明菌株产酸能力强，pH值变化小时产酸能力弱。其中，乳酸菌B1的产酸能力最强，发酵液的pH值共降低1.25；乳酸菌A1和B3的pH值分别降低1.02和1.11。低盐发酵蔬菜中，乳酸菌的适应期越短其繁殖能力越强，能尽快分离出有益物质；乳酸菌的产酸能力决定了产品的风味和口感，也在一定程度上延长了产品的货架期，抑制了腐败菌的生长，起到防腐的作用[17]。因此，选择适应期短、产酸能力强的乳酸菌作为生产用菌株。由此可知，在低盐发酵蔬菜生产中，乳酸菌A1、B1和B3更具潜力。

2.4 耐受性分析

2.4.1 温度耐受性

蔬菜发酵过程中，温度通过影响生物大分子的功能特性、细胞结构以及胞内酶的活性等来影响微生物的生长和繁殖，张兰威[18]的研究表明较高的温度有助于混合生长菌株的比例达到平衡。因此，选择温度耐受性高的菌株，有利于产品品质和风味的提升。

图4 6株菌的温度耐受性曲线Fig.4 Temperature resistance curves of 6 strains of Lactobacillus

由图4可知，乳酸菌A1，B1，B3对温度的耐受性较高，在温度为39 ℃时仍能较好地生长。其余3株乳酸菌对温度的耐受性较差。

2.4.2 pH耐受性

蔬菜发酵过程中，溶液酸度不断增加，pH值逐渐降低。pH对乳酸菌的活性有很大的影响，过高酸度的条件下，乳酸菌的活性受到抑制，影响乳酸菌的生物酶活性以及细胞吸收和代谢的能力[19]。因此，研究乳酸菌对pH的耐受性，筛选出能在高酸性条件下生长的乳酸菌，以维持发酵的正常进行。

图5 6株乳酸菌的pH耐受性曲线Fig.5 pH resistance curves of 6 strains of Lactobacillus

由图5可知，乳酸菌的生长繁殖能力随着pH的增大而增强。pH在4～6时，6株乳酸菌均生长良好；而在pH为2～4时，乳酸菌的生长均受到不同程度的抑制。其中乳酸菌B1在高酸性环境下，表现出较好的pH耐受性。

2.4.3 盐度耐受性

图6 6株乳酸菌的耐盐性曲线Fig.6 Salt resistance curves of 6 strains of Lactobacillus

由图6可知，发酵的过程中，随着盐浓度的升高，6株乳酸菌的生长都受到了不同程度的抑制。但低盐发酵蔬菜中盐浓度都低于6%，因此选择在0～8%盐浓度范围内活性高的乳酸菌作为生产用菌株[20]。乳酸菌A1、B1、B3、C3在低盐浓度下生长良好，较适合于生产发酵。

2.5 乳酸菌B1的16S rRNA序列分析结果

综上试验结果，选择生长迅速、产酸量高，对温度、pH、盐浓度的耐受性都较强的乳酸菌B1进行分子学生物鉴定。电泳检测结果显示乳酸菌B1在约1500 bp之间有明显的电泳条带。

将乳酸菌B1的基因序列与数据库中已有的细菌基因序列进行比对，其序列与植物乳杆菌的同源性为100%。利用MEGA 6.0软件构建系统发育树，结果见图7。乳酸菌B1与植物乳杆菌的系统位置最为接近，与布氏乳杆菌和干酪乳杆菌等形成的同源簇有明显的差异。因此，乳酸菌B1被鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)。

图7 乳酸菌B1基于16S rRNA序列进行构建系统发育树Fig.7 Phylogenetic tree of Lactobacillus B1 based on the 16S rRNA sequence

3 结论

川西彝族传统酸菜作为具有民族特色的健康食品，被越来越多的人们所认同，市场潜力大。然而对川西彝族传统酸菜中功能微生物的研究近乎空白，因此，本文从川西彝族传统酸菜汁中分离纯化出产酸量较高的41株乳酸菌，经抑菌实验，优选出6株抑菌能力较强的乳酸菌，编号依次为A1、B1、B3、C3、D2、F1。为筛选得到适用于低盐发酵蔬菜的乳酸菌，研究了6株菌的生长曲线以及产酸能力、温度耐受性、pH耐受性和盐度耐受性，最终选出综合性能较好的乳酸菌B1，对其16S rRNA序列进行分析，鉴定其为植物乳杆菌。通过一系列理化、耐受性分析发现乳酸菌B1是一株极具应用潜力的菌株。在后续实验中，可将其应用于低盐发酵蔬菜中，进一步优化发酵工艺条件。也可丰富发酵食品微生物，对推动民族食品的开发及工业化生产具有积极的意义。