姚佳烽 姜祝鹏 赵桐 王昊 陈柏 吴洪涛

摘 要 研究了多电极阵列微流控芯片内不同细胞在介电泳力下的运动特征，对外部形态相同而内部组蛋白不同的两种细胞进行了分离。多电极阵列微流控芯片在流道的5个正方形横截面嵌入电极阵列，每个横截面的一组对边嵌入8根电极，此结构扩大了微流道的尺寸，可以实现细胞在介电泳力的作用下高流量分离。为了研究微流控芯片内细胞运动特征，首先通过电场数值分析，对一个横截面内多电极电场分布进行了计算， 得到了最佳电极组合方式，使得电场分布均匀，且介电泳力最大。之后，通过实验分析了在不同频率、多电极复杂电场下，外部形态相同而内部组蛋白不同的人肺部成纤维细胞MRC-5的运动特点。通过对介电泳力的波谱进行分析，得到了野生型（WT）和组蛋白-GFP型（GFP-HT）两种细胞的分离频率为f=30 kHz。最后，在两个入口处通入不同比例的蔗糖（Sucrose）溶液与两种细胞混合液，计算了细胞的分离率。当两个入口的流量比为12∶1时，两种细胞的分离率可以达到93.5%。本研究提出的多电极阵列微流控芯片分离细胞的方法为细胞的高流量快速分离奠定了基础。

关键词 介电泳; 细胞运动; 多电极; 复合电场; 最优电极组合; 微流控芯片

1 引 言

微流控芯片能够在单个紧凑装置中实现多种功能，如细胞分离、计数和裂解分析[1～3]， 目前，有多种微流控芯片可实现细胞分离[4，5]。利用微流体装置进行免标记高速细胞操作是生物医学研究中的重要技术[7～9]， 常见的免标记分离方法有磁学[10，11]、光学[12]，流体力学[13]、声学[14]以及电动学技术[15] 等。在这些技术中，电动学是最有前景的方法之一，它根据电学性质、细胞形态及细胞表面积等的差异，从普通细胞中操纵特定细胞[8，16，17]。电动学分离技术适用于由完全不同的细胞所组成的混合物的细胞操作（如癌细胞和血细胞）。然而，对外部形态相同，而内部组蛋白不同的细胞分离仍存在一些困难。

针对以上问题，研究者开发出了一种面向细胞免标记检测与分离的多电极阵列微流控芯片，该芯片可以实现细胞空间内的高速分离[18～20]。由于多电极阵列的存在，通过选择激励电极的不同组合，可以控制细胞运动的方向和电动力的强度。在介电泳力（Dielectrophoretic force， DEP）、热浮力和电热力等交流电动力中，介电泳力作用于不同细胞，产生不同方向的运动，而其它力则作用于流体，产生涡流运动，以推动细胞向电极方向靠近[21]。目前，将多电极阵列微流控芯片应用于由外部形态相同，但细胞内组蛋白不同的两种细胞的高速分离，尚未得到充分研究。

本研究采用已开发的多电极阵列微流控芯片，首先通过数值计算，得到了最优电极组合方式，以得到均匀的电场分布与最大的介电泳力。针对人肺成纤维细胞 （Medical research council cell strain 5，MRC-5），采用带负电荷的绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein， GFP）和带正电的组蛋白（Histone，HT）改变细胞内部的成分，研究了绿色荧光蛋白（GFP）标记的组蛋白-GFP细胞（GFP-HT）与野生型细胞（Wild type， WT）的不同运动。最后，通过实验方法，对WT和GFP-HT两种细胞进行了分离。本研究提出的多电极阵列微流控芯片分离细胞的方法， 为高通量分离细胞提供了技术基础。

2  实验方法

2.1 仪器与试剂

Eclipse LV 100显微镜（日本Nikon公司），配备有50倍物镜（NA=0.55）、Fastcam SA3高速相机（日本Photron公司）。

人成纤维细胞来源的MRC-5 SV1 TG1细胞系（日本RIKEN BioResource Research Center ）; 10%胎牛血清（日本Nacalai Tesque公司）; 青霉素、链霉素、低葡萄糖Dulbecco改良伊格尔液（美国GIBCO公司）。

2.2 实验方法

2.2.1 微流控芯片加工 多电极阵列微流控芯片的制作过程如下：（1）利用光刻法在石英平板上沉积5片10 μm的电极，电极之间间隔为200 μm; （2）在沉积好的电极上再铺一片石英平板，构成一个电极夹层; （3）在铺好的第二层石英平板上继续利用光刻法沉积第二层的5个电极; （4）重复之前的方法，共沉积4层电极; （5）在石英与电极夹层的结构上开出方形槽，作为流道，即可在流道周围形成5个横截面电极。加工方法步骤与文献[18]类似，但文献[18]采用菱形结构的微流道，而本研究的微流道是方形结构。

2.2.2 样品制备 制备通过转染绿色荧光蛋白融合组蛋白修饰的MRC-5人肺成纤维细胞系，以观察WT细胞系和GFP-HT細胞系细胞内电荷变化的效果。GFP-HT质粒和转染程序参照文献[22]方法。将稳定表达GFP融合组蛋白的MRC-5细胞（GFP-HT细胞）和野生型MRC-5细胞（WT细胞）培养在有10%胎牛血清和青霉素/链霉素（分别为50 u/mL和50 μg/mL）的低葡萄糖Dulbecco改良伊格尔液中。在多电极阵列微流控芯片分析细胞运动的实验中，将细胞用胰蛋白酶消化并重悬于Dulbecco磷酸盐缓冲液（D-PBS）中，调整最终密度为1.0 × 106 cell/mL。

2.2.3 实验过程 为了避免细胞电致穿孔现象，采用了交流电压输入，电压Vpp=20 V，频率f=10 MHz。 交流电显著降低了细胞膜内外的电势差，因而避免了细胞电致穿孔现象。在实验中，在多层电极微流控装置的主流通道中填充细胞悬浮液后，将AC电压施加到第一和第三层电极，而第二和第四层电极被设定为接地。用显微镜观察由于施加电压引起的细胞颗粒运动。焦平面被设置为电极的第一层，在施加交流电压后，以60 fps捕获图像。

采用粒子跟踪测速（PTV）技术，通过拉格朗日方法在x-z平面跟踪流体中的单个细胞。x-z平面平行于电极层， x方向垂直于电极，朝向多层电极微流控装置主流通道的中心区域。考虑时间变化，计算细胞的速度，比较3种细胞之间的细胞颗粒运动。在对电极施加交流电压的状态下，以0.1 s的时间间隔依次追踪距离电极（25 ± 5） μm的中心线（z=0）附近的细胞，使用内部开发的图像分析程序计算细胞的轨迹。

2.3 多电极电场分布计算

本研究讨论的交流电场控制方程是麦克斯韦方程组。在电场是角频率为ω时间谐波，并且没有相位滞后的情况下，可以使用电场的复数表示法=E0exp（jωt），其中电场的相量幅度E0是实数。对于微电极结构，磁效应可以忽略不计[20]。因此，复杂形式的麦克斯韦方程简化为：

其中，σ和ε是流体的电导率和介电常数， ρe是局部电荷密度，u是流体速度。式（1）表明，可采用复合电势描述复合电场，即：

其中，0是电势的相位幅度。式（2）中的对流项ρeu是可以忽略的，因為在此条件下电雷诺数估计为Reel=U/（σD）～10111[14]。此外，假设电导率和介电常数的空间变化很小，通过应用小扰动理论[4]，式（2）和式（3）减小到拉普拉斯方程的电势，20=0。为了方便描述电动运动的时间平均效应，本研究采用复合场相量幅度的均方根（RMS）场。相应地，拉普拉斯方程=02求解，之后，静电场E=Ε0/2的RMS由式（4）计算：

多电极电压施加方式分类，其中数字①②③④代表微流道单侧电极序号。单侧4个电极施加电压方式分为4类（A、B、C和D）：A（10××）、B（1000）、C（1001）、D（1010）。以A（10××）为例，其含义为，第一个电极加电压（用1表示），第二个电极接地（用0表示），第三、四个电极空置不使用（用×表示），具体分类见表1。

2.4 正负介电泳（DEP）

为了分离两种细胞，需要得到不同方向的DEP力。分析产生DEP力的公式，在交流电作用下，介电泳（DEP）力可表示为：

其中，dc是细胞直径， εf是溶液介电常数，ω是外加电场的角频率，Erms是电场强度的均方根。 Re[CM（ω）]是方程（5）中复数CM（ω）的实部。

实际材料的介电常数和电导率仅是在特定频率下材料的“常数”，并反映了在该频率下极化与场强关系的斜率。通常，介电常数和电导率是频率的单调变化函数。悬浮体和周围介质之间这些变化的相互作用引起介质中物体的净极化，介质在频率范围内可能具有相当复杂的形状。

其中，εc 和εf是细胞和流体的复介电常数。式（6）在一定频率范围内具有正值和负值，就产生了正、负介电泳，即DEP力对于 Re[CM（ω）]的正值是正的，对于Re[CM（ω）]的负值是负的。

单个细胞在流体中运动受力为：

其中， mc为细胞的质量，uc为细胞的速度，FD为细胞受到流体的曳力，其表达式为：

3 结果与讨论

3.1 两类细胞的结构特点

在细胞和分子生物学中，蛋白质印迹法是用于鉴定蛋白质的重要技术[23]。根据显微镜观察和蛋白质印迹法对细胞内蛋白质成分的鉴定[18]，建立了GFP-HT和WT两种细胞的示意图。两类细胞在相衬图像和荧光图像中的观察结果如图3右方所示。相衬图像表示了细胞的结构，荧光图像显示了细胞中GFP的量。从荧光图像中可以看出，GFP-HT细胞显示斑点状结构， 表明对于GFP-HT细胞，GFP仅出现在细胞核中。在本研究中，蛋白质印迹法确定了两种细胞中的蛋白质类型与含量，各种蛋白质成分含量影响两种不同细胞的电气参数，对细胞分离起到了关键作用[22]。此细胞示意图为实验研究中分析细胞介电泳运动提供了基础。

3.2 细胞悬浮液的电学性质

细胞悬浮液的电学参数决定了介电泳力的正负值，本研究考察了不同细胞悬浮液的电学参数特点。在f=0～5 MHz时，对比WT、GFP-HT和蔗糖（Sucrose）3种溶液的相对介电常数。随着频率增大，相对介电常数都下降，这是因为电容成分在高频下逐渐被导通。由于细胞的导电性比蔗糖大，蔗糖的相对介电常数值明显低于两种细胞悬浮液。3种溶液的相对介电常数在不同频率下都存在差别，可以产生不同的介电泳力，不同介电参数的细胞可以实现分离。为实现细胞分离所需的确切频率值，以及产生更大介电泳力的多电极如何组合，需要通过仿真与实验进一步分析。

3.3 多电极电场的计算

本研究采用多电极微流控芯片实现高速细胞分离，施加电流时，不同的电极组合方式会产生不同的电场分布，进而影响细胞分离效果。因此，本研究采用数值计算寻找最佳的电极组合方式。

多电极阵列微流控芯片一个横截面内不同电极组合的电场分布数值计算结果。其中，组合方式B（1000）、C（1001）和D（1010）得到了y方向上较均匀的电场，容易在x方向得到均匀分布的DEP力; 组合方式A（10××）的电场强度主要集中在右上方，无法在整个横截面上施加DEP力。定量对比了电场强度的大小与分布均匀性，  组合方式D（1010）中，第1和3根电极施加电流，2和4电极接地， 能够在y方向上得到相对均匀的电场强度平方的梯度。由式（5）得知，电场强度平方的梯度与DEP力成正比。根据式（5），此组合方式也可在y方向上产生较大且均匀的DEP力。故选择组合方式D（1010）为最佳电极组合方式，进行细胞的运动分析。

3.4 不同细胞运动对比分析 按照组合方式D（1010）施加电场后，在不同频率下分析了野生型（WT）细胞和组蛋白-GFP（GFP-HT）型细胞的运动方向与速度。对于两种细胞，在施加频率为f=10 kHz时，运动方向均为远离电极的方向，表明在此频率下，两种细胞均受到负DEP力; 在施加频率为f ≥ 100 kHz时，运动方向均为靠近电极的方向，表明两种细胞受到了正DEP力。颜色也表明，越靠近电极，运动速度越大。

能够同时对两类细胞产生正与负的DEP力的频率被称为分离频率。为了更加定量化确定细胞运动方向与分离频率的关系，对细胞在不同频率下的Re[CM（ω）]进行了实验分析。对于WT细胞，在频率为f=25 kHz时，Re[CM（ω）]=0，说明f=25 kHz是WT细胞产生正负DEP力的分界点; 对于GFP-HT细胞，f=35 kHz时，Re[CM（ω）]=0，说明f=35 kHz是GFP-HT产生正与负的DEP力的分界点。

负的Re[CM（ω）]产生负DEP力，细胞远离电极运动; 同样地，正的Re[CM（ω）]产生正DEP力，细胞靠近电极运动。因此基于实验结果，可以取f=30 kHz为两种细胞的分离频率。

从等效电路的观点来看，对于一个单细胞，细胞膜具有电容成分，可等价为电容器，细胞质及细胞核可等价为电阻。对于两种类型的细胞，不同的运动最初来自细胞内成分中的蛋白质量。具有较小介电常数的组蛋白GFP型细胞在电场作用下表现出较低的极化效应，产生不同的Re[CM（ω）]，并对应不同方向的DEP力。

3.5 細胞分离应用

利用以上分析结果，对多电极阵列微流控芯片5个横截面的单侧电极都采用D（1010）类型的电流施加方式，施加f=30 kHz的电流，对两种细胞WT和GFP-HT进行了分离实验。在传统的微流体装置中，流体动力聚焦是通过多个泵和/或压力源仔细控制流速实现的。本研究中的分离实验采用的微流控芯片有3个入口，采用位于两边的2个入口可以使细胞运动形成鞘流（Sheath flow），从而缩小了细胞悬浮液流动的区域，使细胞悬浮液聚焦于一侧电极界面附近，并大大减小了扩散距离。

入口A通入蔗糖溶液，入口B通入WT与GFP-HT两种细胞混合液。调整入口A和B的流量，可以调整细胞混合液的在微流道内的浓度。通过检测出口A和B中两种细胞的浓度，可以得到细胞分离率。结果表明，增大入口A的入口流量，可以显著提高分离率。当入口A与B的流量比为12∶1时，细胞分离率可达到93.5% （表2）。当细胞浓度过大时，细胞间的干涉强烈，不利于WT和GFP-HT两种细胞的分离。

4 结 论

利用多电极阵列微流控芯片的特殊结构，在不同频率、多电极复杂电场下，研究了外部形态相同而内部组蛋白成分不同的人肺部成纤维细胞MRC-5的运动特点。通过对一个横截面的电极阵列进行数值计算，可以发现，横截面内单侧4个电极交替施加电流时，可以得到均匀的电场分布与最大的介电泳力。进一步通过实验对MRC-5野生型（WT）与组蛋白-GFP型（GFP-HT）细胞进行了介电泳力的频谱分析，发现在多电极电场下两种细胞的分离频率为f=30 kHz。细胞分离实验结果表明，较小的细胞混合液可以得到较大的分离率， 即当入口A与B的流量比为12∶1时，细胞的分离率可以达到93.5%。 本研究提出的多电极阵列微流控芯片分离细胞的方法为细胞的高流量分离提供了研究基础。

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