汪良峰，陈海英，俞建峰，崔政伟

（江南大学 江苏省食品先进制造装备技术重点实验室，江苏 无锡214122）

关键字：蒸汽；鲜榨苹果浆；褐变；抗氧化性；风味物质

中国是世界上苹果第一生产大国，总产量已超过世界总产量的55%[1]。如此庞大的产量已远超鲜销市场的需求，苹果深加工已然迫在眉睫。我国苹果汁加工产业起步晚，年加工用果仅占苹果总产量20%，而欧美国家已经达到50%以上[2]。

褐变一直是制约国际苹果汁行业发展的关键难题。褐变是指苹果在制浆后颜色呈褐色以及在贮藏中褐色加深的现象[3]。褐变不仅影响苹果浆的外观、口感和风味，还造成营养成分的流失，降低果浆营养价值和商品价值。

近年来有很多学者做了关于苹果汁防褐变的研究，如李敏等采用添加树脂、活性炭等措施控制苹果汁颜色加深[4-5]，Thada等添加豆香素等植物提取物防止苹果汁酶促褐变[6-7]，Riahi等采用超高压灭酶防止酶促褐变[8-9]，但同时也产生营养物质流失，生产成本高，难以实现大规模工业化生产等问题。蒸汽处理能防止鲜榨苹果浆褐变，同时工序简单，生产成本低。作者用自行设计、搭建的试验装置，实现破碎制浆和蒸汽灭酶工艺耦合，探讨蒸汽环境制浆对果浆色泽、理化性质、抗氧化性、风味物质保留的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

苹果：市售，选取大小均匀、颜色相近的苹果，贮藏于4℃备用；仲辛醇、没食子酸、自由基产生剂偶氮二异丁脒盐酸盐 （AAPH）、荧光物质Sodium Fluorescein：阿拉丁试剂有限公司产品。

1.2 仪器与设备

LDR24-0.45-Z全自动小型电加热蒸汽锅炉：顺达服装机械有限公司产品；TM-767II多功能果蔬破碎机：海盘电器有限公司产品；UPLC-TQD超高效液相色谱串联四级杆质谱联用仪：美国waters公司产品；UltraScan Pro1166高精度分光测色仪：美国Hunter lab公司产品；PowerWave XS2酶标仪：美国Bio Tek公司产品；TGL-16C高速离心机：安亭科学仪器厂产品；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器：予华仪器有限责任公司产品；UV1800紫外可见光分光光度计：日本岛津公司产品；LZB-10WB玻璃转子流量计：祥云流量仪器厂产品；PHS-4CT型智能台式pH计：康仪仪器有限公司产品；PAL-1手持数显糖度计：日本爱拓公司产品；CENTER-309温度计：群特科技股份有限公司产品；AR1140分析天平：美国奥斯豪仪器有限公司产品。实验装置简图如图1所示。

图1 自制蒸汽灭酶与破碎制浆耦合实验装置简图Fig.1 Sketch for self-designed equipment of coupling steam inactive enzyme and break pulp

1.3 试验方法

试验前将苹果从冷藏柜中取出，置于25℃水浴中1 h后，去皮、去核、切块，每份100 g，然后装入果蔬破碎机中待打浆处理。通过打浆前和打浆过程中持续向破碎腔中通入适当蒸汽实现蒸汽灭酶和破碎制浆耦合，试验装置如图1。前期多次尝试性试验结果表明，当通入压强0.13 MPa、温度107℃的1 750 L/h高温蒸汽 （以下高温蒸汽的条件均相同）100 s时，果浆温度已经达到95℃；而通入750 L/h蒸汽50 s时，果浆褐变依然很明显。作者研究方案为蒸汽流量取 1 000、1 250、1 500、1 750 L/h， 通入蒸汽时间取 50、60、70、80、90 s。 每组试验做 3 个平行，记录色值和打浆结束时果浆温度。

1.3.1 苹果浆色泽测定 鲜榨果浆自然冷却10 min中后用hunter lab高精度分光测色仪进行色泽测定。 白板校准值为：L0=93.5、a0=-0.84、b0=0.66；L表示明度L=0指示黑色L=100指示白色。

1.3.2 苹果浆PPO活性测定 参考Krapfenbauer等[10]的方法，略有改动。取10 mL鲜榨果浆与20 mL 4 g/dL PVPP充分混合后在12 000 r/min离心20 min后取上清液，即为PPO粗酶液。比色皿中加入2.5 mL磷酸盐缓冲液 （pH 6.5），30 s后加入0.5 mL粗酶液，30 s后再加入1 mL邻苯二酚 （0.2 mol/L），混合均匀后立刻在420 nm波长下测定吸光值，连续测定2 min。酶活性（U）由开始处反应速率决定。作者通过蒸汽环境打浆与常温（25℃）打浆的对比，来探究破碎制浆耦合蒸汽灭酶对鲜榨果汁的影响，故用实测果浆PPO活性与果浆25PPO活性做比，得到相对活性R，计算式：

式中：U为蒸汽环境打浆的果浆PPO活性，U25为对照果浆25PPO活性。

1.3.3 苹果浆总酸测定 参考GB/T 12456—2008食品中总酸的测定。

1.3.4 苹果浆总酚测定 采用Folin-Ciocalteu法[11]，略有改动。鲜榨苹果浆稀释10倍，过滤，取1 mL滤液于试管中，加入2.5 mL福林—酚试剂，混合均匀后加入4.0 mL质量分数12%的Na2CO3溶液，在45℃水浴中反应1.5 h后，在756 nm波长处测定吸光值。用没食子酸制定标准曲线。

1.3.5 苹果浆总糖测定 参考 Zhao等方法[12]。取20 g鲜榨果浆与10 mL盐酸（体积分数10%）充分混合后加入80 mL去蒸馏水水，过滤后留滤液备用。具塞试管加入2 mL备用滤液后立即加入8 mL蒽酮试剂 （0.2 g蒽酮溶于100 mL浓硫酸，现配限用），在100沸水浴中加热10 min，冰浴冷却室温后在波长620 nm处测量吸光值。用葡萄糖溶液制定标准曲线。

1.3.6 苹果浆抗氧化性测定 参考徐维盛等方法[13]。取10 g果浆与20 g乙醇（体积分数50%）混合均匀后，12 000 r/min离心20 min，取上清液，即为待测样品溶液。用pH 7.4的磷酸盐缓冲液配制适当浓度的荧光素钠盐、AAPH溶液。在96孔黑色荧光酶标仪板各孔加入25 μL样品溶液后，用自动加样器向各微孔中添加浓度为0.159 μmol/L的荧光素钠盐75 μL；37孵育10 min后，用自动加样器加入浓度38.25 mmol/L的AAPH溶液100 μL。以激发波长485 nm，发射波长530 nm进行连续反应，每70 s测定一次荧光强度，持续4200 s，整个体系维持37℃。试验所得不同时间荧光强度与初始时间荧光强度相比，折算成相对荧光强度f，采用近似积分计算出荧光衰退曲线下方面积（AUC），如式：

式中，fn为第n个测定点相对荧光强度；Δt为相邻两测定点时间间隔，70 s。

计算样品AUC与仅有APPH作用下的AUC之差得到净AUC，用样品net AUC来表征蒸汽对3种苹果浆抗氧化活性的影响。

1.3.7 苹果浆风味测定 采用顶空固相微萃取结合气相色谱—质谱联用（GC-MS）技术对苹果浆风味物质成分及含量测定[14]。取2 g样品和3 mL蒸馏水置于20 mL样品瓶中，加入2 g促进风味物质挥发的NaCl，用 2 μL 1.6 mg/mL的2-辛醇作内标，之后在40℃加热平衡台上平衡10 min。萃取头插入250℃的GC进样口老化30 min后插入已平衡好的样品瓶中吸附，再插入GC进样口解吸。气相色谱条件：Agilent HP-5毛细管柱，氦载气流量1 mL/min，进样口温度250℃，不分流；升温程序为，起始柱温35℃，维持1 min以后以1℃/min速率增加至70℃，维持2 min，再以5℃/min速率升温至230℃，维持5 min。质谱条件：接口温度280℃，采用电子轰击离子源（EI），离子源温度230℃，四级杆温度150℃，电子能量70 eV，捕获方式为全扫描（m/z30～600）。

2 结果与讨论

2.1 蒸汽对鲜榨苹果浆褐变影响

从图2中可以看出，打浆结束时果浆温度和蒸汽处理时间基本呈正向线性关系，而L值这种变化趋势并不明显。图2（b）中，在蒸汽流量低于1 250 L/h，蒸汽时间小于80 s时，果浆颜色相对较深，和未蒸汽处理的对照组相差不大。在蒸汽流速大于1 500 L/h、蒸汽时间大于60 s时鲜榨果浆L值较大；并且在蒸汽时间超过70 s后，随着蒸汽时间增加L值变化平缓。图2（b）中，在纵坐标L值为50左右（L*）画条横线（分界线），发现在分界线以下的试验点（褐变试验点）偏离分界线均比较远。说明这些褐变试验点在打浆结束后10 min内颜色变化很快、幅度大。鲜榨果浆破碎时颜色变化主要由酶促褐变产生[15]，由此可以推测这些褐变试验点在打浆结束后10 min内发生了剧烈的酶促褐变反应。在分界线以上的试验点（有效试验点）离分界线均相对较近，且变化平缓，说明有效试验点L值在超过L*后变化很小；此时果浆色泽明亮、稳定，酶活性较弱。温度是影响酶活力的最主要因素，在图2（a）中以褐变试验点为参考画出一条直线。这条直线代表的温度（T*=80℃左右）表示为本实验方案下酶有效失活温度。

在图2（a）中有部分试验点虽然果浆L值大、褐变程度小，但打浆结束温度已经超过95℃，已经严重影响到果浆的品质[16]。结合果浆褐变程度，在打浆结束时温度 25℃、70～80℃、80～90℃、90～100℃ 4个阶段分别取一个试验点进行后续相关指标测定。4个试验点参数如表1。

图2 不同蒸汽处理对鲜榨果浆温度和L值影响Fig.2 Effect of steam treatment on temperature and Lvalue of fresh apple juice

表1 4个试验点参数Table 1 Parameters of four test point

2.2 蒸汽对鲜榨苹果浆PPO活性影响

由图3可以看出打浆结束时温度在80℃以上的P3、P4试验点酶活性很低，仅有对照P1试验点10%左右；P2试验点虽然温度也达到了73℃，依然有66%的活性。这个现象与上文中蒸汽环境打浆果浆PPO活性在T*有临界点的推测相符合。从图4中4个试验点打出果浆10 min后拍照图，很清楚的看出蒸汽环境打浆结束时温度高于T*的P3、P4试验点，果浆中PPO活性基本得到钝化，酶促褐变基本得到抑制。

图3 4个试验点果浆温度及果浆相对酶活性Fig.3 Pulp temperature and relative enzyme activity of four test points apple juice

图4 4个试验点打出果浆10 min后拍照图Fig.4 Photo graph for four test points apple juice after 10 min of breaking

2.3 蒸汽对鲜榨苹果浆理化性质影响

结合2.1、2.2结论选择了试验点P4、P3以及对照组P1进行后续分析试验，并把制的果浆以打浆结束时果浆温度分别命名为：果浆93（打浆结束时果温度93℃，以下类同）、果浆83、果浆25。

3种果浆部分理化性质如表2所示。果浆83、果浆93总酚含量比果浆25要高很多，这和文献[17]试验结果相一致。酚类是果浆中很重要的营养成分之一，酶促褐变的有效抑制极大的提高了果浆营养价值。总酸的增加、pH降低和文献略有不同[18]，其中机理也尚不清楚，酸性物质的增加对改善苹果浆酸甜可口的口感有很大帮助。果浆83、果浆93总糖含量明显比果浆25要低，而且果浆83也比果浆93要高；这应该是由蒸汽环境打浆随着温度的升高加剧了糖类焦化反应导致的。由此可以看出，在蒸汽环境中打浆虽然糖类有所流失，有利于酚类和酸性物质的保留。

表2 蒸汽处理对果浆理化特性影响Table 2 Effect of steam treatment on physical and chemical properties of apple juice

2.4 蒸汽处理对抗氧化性影响

氧自由基吸收能力能很好的表征苹果浆抗氧化活性。3种果浆荧光衰减情况如图5所示，果浆25荧光衰减速度明显比果浆83、果浆93要快很多；3种果浆净 AUC分别为 1555.694、3196.466、3738.196，从中可以看出果浆83、果浆93在氧自由基吸收能力上比果浆25要好很多，说明蒸汽环境打浆增加了果浆的抗氧化性。这和蒸汽环境打浆有效抑制了酶促褐变，保留果浆中酚类、黄酮类化合物有关[19]。果浆93的抗氧化性比果浆83要好，说明果浆抗氧化性增加依赖于打浆结束时温度的升高；适当提高打浆结束时温度更有利于抗氧化性增加，但也不可避免的带来其他影响。

图5 3种果浆荧光衰减图Fig.5 Fluorescence decay of three apple juice

2.5 蒸汽对鲜榨苹果浆风味影响

采用顶空固相微萃取气—质联用技术从3种鲜榨果浆中检测出大约230种物质，其中主要的挥发性风味物质（相对质量分数≥0.1%）有45种，如表3所示。主要风味物质有醇类、酯类、醛类、酮类、烯烷炔，其中醇类和酯类种类最多，分别有12种、10种。3种果浆检测出的化合物种类及质量分数如图6所示，从中可以看出果浆中挥发性风物物质种类虽然很多，但相对质量分数超过0.1%化合物（C类化合物）种类却很少，仅占所有物质种类16%左右。果浆83、果浆93中挥发性风味物质种类比果浆25增加了30种左右，这应该和蒸汽环境打浆果胶酶将半乳糖醛酸分解为小分子的挥发性风味物质有关[20]。C类化合物含量总和在通入蒸汽后变化非常明显，在没有通入蒸汽的果浆25中达到50.37%，而通入蒸汽后的果浆93、果浆83中分别仅有22.44%、19.25%。通入蒸汽后，C类化合物含量的降低可能由两部分造成：一部分是低沸点风味物质在高温打浆环境中提前挥发；另一部分是高温致使一些风味物质分解。

表3 3种果浆中主要挥发性风味物质Table 3 Main volatile flavor compounds of apple juice

续表3

图6 3种果浆检测出的化合物种数及相对质量分数Fig.6 Number of compounds detected and relativecontent of apple juice

按化合物种类和相对质量分数对C类化合物进行了分类分析，结果如表4。果浆93、果浆83与果浆25相比醇类、醛类、酮类的物质种类没有明显的变化，酯类、烯烷炔变化明显，其中酯类物质种类减少了100%左右。5类物质在相对质量分数上均有明显变化，尤其是醛类变化最大，相对质量分数降低了90%以上，醇类、酯类、分别降低了50%、70%左右，酮类质量分数虽然有所增加，但相对质量分数很低仅有0.5%左右。

表4 3种果浆中几种主要挥发性风味物质种数和相对质量分数Table 4 Species and relative content of several kinds of main volatile flavor compounds of apple juice

蒸汽处理对果浆中挥发性风味影响明显，通入蒸汽后虽然化合物种类略有增加，但影响果浆风味最大的3类物质，醇类、酯类、醛类损失较多，并且打浆结束时温度越高，损失越明显。

3 结 语

通过采用小型蒸汽灭酶与破碎制浆耦合实验装置在蒸汽环境对苹果破碎进行打浆试验，发现合适的蒸汽处理可以抑制果浆的酶促褐变，改善果浆色泽；果浆PPO在打浆结束温度80℃以上基本失活。进一步对果浆93、果浆83和果浆25进行了理化性质、抗氧化性、风味物质的比较分析。发现蒸汽环境打浆由于有效的抑制了酶促褐变，改善了果浆理化性质，同时极大的保留了果浆的抗氧化活性；同时由于蒸汽的通入升高了果浆温度，损失了果浆中风味物质，并且这种损失随着打浆结束时温度的升高而增加。蒸汽环境中打浆，通过合理控制蒸汽用量可以达到，灭酶防褐变，改善果浆品质的效果。

蒸汽环境打浆工艺简单，适合工业化生产，目前作者正在研制成熟的适合大规模生产的苹果蒸汽破碎机。