王 杜 孙君军 刘伟峰 杨延辉 褚智杰 杨 成 杨天保 桂 洋

急性坏死性胰腺炎(acute necrotizing pancreatitis，ANP)是种起病急、病情变化快，病因复杂、病死率高的临床常见急危重症，其对生命的威胁，不仅在疾病本身，更在于ANP时炎性因子激活后的炎症级联放大反应，波及全身而引起严重并发症，其中以急性肺损伤(acute lung injury，ALI)为最常见的早期并发症[1,2]。有关ANP及其并发症治疗的研究多从体液调节的角度出发，2000年有研究人员提出胆碱能抗炎通路的新概念，强调神经系统在抗炎过程中的重要作用，这为ANP抗炎治疗提供了新思路[3, 4]。本研究通过检测实验动物模型血清P、E选择素等生化指标变化，结合肺组织病理，探索内脏大神经在ANP急性肺损伤时的保护作用。

材料与方法

1.实验动物与试剂：健康雄性(1～2周岁)杂种犬24只，体重10～15kg，购于河南科技大学实验动物中心，实验动物许可证号：SYXK(豫)2016-0010，对实验动物的处理经河南科技大学动物伦理学委员会讨论通过。按照随机数字表法将犬分为假手术组(SO组)8只；急性坏死性胰腺炎模型组(ANP组)8只，实验途中死亡2只；ANP+内脏大神经切断组(GSNT组)8只。实验途中死亡犬放弃数据统计。牛磺胆酸钠及胰蛋白酶购于美国Sigma公司，P-selectin、E-selectinELISA试剂盒购于上海钰博生物科技有限公司。

2.术前准备：备皮，剃去腹部及前后肢毛发；测量体重。术前禁食12小时，自由饮水。实验前1h配置牛磺胆酸钠和胰蛋白酶混合制剂。

3.模型制作：术前15min肌注硫酸阿托品(0.1mg/kg)，舒泰50(15mg/kg)肌注诱导麻醉。犬麻醉成功后取仰卧位固定于动物实验手术台，前肢置入静脉留置针1枚，丙泊酚[15mg/(kg·h)]泵入以术中维持麻醉状态。腹部常规消毒铺巾，取腹部正中切口，逐层进入腹腔，无菌湿纱布保护切口，GSNT组暴露双侧肾上腺并细心解剖分离肾上腺后上方内脏大神经，挂线标记以备用，SO组、ANP组免去挂线步骤。随后各组均在距幽门10～12cm处十二指肠前外侧壁做2cm纵行切口，充分显露可于肠腔内后壁黏膜面见一直径1.0～1.5mm白色脐样凹陷，即为副乳头(主胰管开口处)，沿此置入硬膜外麻醉导管(1.0mm)，进深5cm左右。固定硬膜外导管后，ANP、GSNT组经微量泵向主胰管内以7.6kPa恒定压力注入5%牛磺胆酸钠(0.5ml/kg)和胰蛋白酶(3000U/kg)混合制剂诱导ANP，注射完毕后，观察5min，见胰腺组织出现点状或片状出血、坏死，提示模型初步建立；SO组经微量泵以相同压力及泵速注入等量生理盐水。拔除导管仔细横行缝合肠壁切口。GSNT组再次观察5min，提起挂线剪断双侧内脏大神经。最后逐层关闭腹部切口，消毒包扎。术中均以动物实验用心电信号采集系统进行心电监护。

4.术后维护支持及管理：全部动物制模完成后，禁食、禁饮。放置于清洁循环良好标准动物实验室内，专人陪护，观察犬生命体征变化及手术切口。经留置针完全肠外营养支持，按非蛋白热量50kcal/(kg·d)和含氮量0.3g/(kg·d)，总补液量为60ml/(kg·d)比例补液，并补足每天体液丢失量。观察并记录动物心率、呼吸等生命体征，记录24h尿量、大便次数及性状，恶心、呕吐情况，以及精神状况。

5.标本采集与检测方法：分别于术前2h、术后12h、24h、3天、5天、7天采集外周静脉血3ml，1ml用于淀粉酶、白蛋白(试剂盒由河南科技大学临床医学院检验科提供)测定；2ml血液肝素抗凝，高速离心后取上清液置于EP管中，-80℃冰箱保存，用ELISA试剂盒和酶标仪测定A值后计算血清P-selectin、E-selectin水平。术后第7天统一处死实验犬，取胰腺、肺组织标本行病检及病理学评分。胰腺病理学评分以改良Schmidt为评价标准，观察组织水肿、坏死、出血、炎症对胰腺损伤进行病理学计分[5, 6]。参照 Hofbauer等[7]方法，观察肺组织水肿、炎性细胞浸润和出血对肺损伤进行病理学计分。

结 果

1.术前2h各组检测结果比较：术前2h 3组AMY、ALB、P-selectin及E-selectin血清浓度检测结果比较，差异无统计学意义(P>0.05)，各组间具有可比性(表1)。

表1 术前2h 3组血清淀粉酶、白蛋白、P选择素、E选择素检测

2.术后各时间点3组血清AMY水平比较：ANP组、GSNT组血清AMY水平与SO组比较明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；ANP组与GSNT组比较，差异无统计学意义(P=0.121)；ANP组与GSNT组AMY水平于术后第1天出现峰值，随后检测呈下降趋势；SO组AMY水平无明显波动(表2)。

表2 术后各时间点3组血清AMY检测

3.术后各时间点3组血清ALB水平比较：ANP组、GSNT组血清ALB水平与SO组比较明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；ANP组与GSNT组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；ANP组、GSNT组术后血清ALB水平均呈下降趋势(表3)。

表3 术后各时间点3组血清ALB检测

4.术后各时间点3组血清 E-selectin水平比较：ANP组、GSNT组血清E-selectin水平与SO组比较明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；ANP组血清E-selectin水平较GSNT组升高明显(P<0.05)，差异有统计学意义(表4)。

表4 术后各时间点3组血清E-selectin检测

5.术后各时间点3组血清P-selectin水平比较：ANP组、GSNT组血清P-selectin水平与SO组比较明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；ANP组血清P-selectin水平较GSNT组升高明显，差异有统计学意义(P<0.05)(表5)。

表5 术后各时间点3组血清P-selectin检测

6.胰腺及肺组织病理变化：(1)胰腺光镜下病理改变：SO组胰腺组织光镜下结构基本正常(图1A)；ANP组胰腺腺泡水肿，小叶结构破坏，大量炎性细胞浸润，组织出血、坏死明显(图1B)；GSNT组散在炎性细胞浸润，出血、坏死及小叶结构破坏情况较ANP组轻(图1C)。(2)肺组织光镜观察：SO组肺组织光镜下无明显病变，肺泡结构清晰(图2A)；ANP组光镜下可见肺泡壁水肿增宽，间质血管充血、出血明显，炎性细胞浸润(图2B)；GSNT组肺泡壁水肿，间质血管充血、出血，炎性细胞浸润，病变情况较ANP组轻(图2C)。(3)胰腺组织病理评分：SO组病理评分明显低于其他两组，差异有统计学意义(P<0.05)；ANP组评分明显高于GSNT组，差异有统计学意义(P<0.05)(图3)。(4)肺组织病理评分：SO组病理评分明显低于其他两组，差异有统计学意义(P<0.05)；ANP组评分明显高于GSNT组，差异有统计学意义(P<0.05)(图4)。

7.实验中途犬死亡情况：SO组、GSNT组实验途中无犬死亡情况；ANP组实验中途死亡两只，立即进行尸体解剖。1只于第3天因感染性休克死亡，1只于第4天死于肺损伤所致呼吸衰竭。

图1 各组胰腺组织光镜下病理改变(HE,×200)

图2 各组肺组织光镜下病理改变(HE,×200)

图3 3组胰腺组织病理学评分与SO组比较,*P<0.05；与ANP组比较，#P<0.05

图4 3组肺组织病理学评分与SO组比较,*P<0.05；与ANP组比较，#P< 0.05

讨 论

ANP时多种炎性介质及细胞因子间级联反应使胰腺局部炎症进展至全身炎性反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)、 多脏器损伤，最终致MODS[8, 9]。肺是病理进展中最先累及的胰腺外器官，表现为急性肺损伤(ALI)。中性粒细胞是引起肺损伤的主要效应细胞，炎性反应时P选择素、E选择素参与并启动了中性粒细胞与内皮细胞的接触与黏附，使中性粒细胞在肺中大量“滞留”，后者可通过释放其他炎性介质，激活肺血管内皮细胞表达选择素进而形成“级联反应”，加重肺组织损伤[10～12]。可以说，ANP病程进展中，P选择素、E选择素介导的黏附过程对炎性反应扩布起到了重要作用。

ANP时机体炎性反应失控、应激反应，交感神经张力高于迷走神经。前者参与调控炎性反应的通路主要为“下丘脑-垂体-肾上腺轴(hypothalamus-pituitary-adrenal axis，HPAA)”， HPAA是人体内分泌系统重要组成部分，亦是“神经-内分泌-免疫网络”的重要体现[13]。过度兴奋的交感神经可导致血清糖皮质激素、儿茶酚胺等水平升高，进而引起淋巴细胞增殖减少、NK细胞活性下降、抗体生成水平降低等免疫改变，致机体免疫反应降低[14]。过去的研究强调抗炎机制是通过体液途径来实现的，自Borovikova等[3]在2000年首次提出 “胆碱能抗炎通路”的概念至今，更多的研究证实神经系统可参与调控炎症反应并能起到重要作用[15～17]。因此胆碱能抗炎通路的发现，不仅建立了神经系统与免疫系统之间的联系，更为治疗ANP时失控的炎性反应提供了一个新思路。

本研究以犬为研究对象建立ANP模型，采用离断腹腔双侧内脏大神经达到减低交感神经张力的作用，通过检测血清P选择素、E选择素、淀粉酶、白蛋白水平以及胰腺、肺组织病理评分，认识神经系统对ANP时肺组织的影响。实验发现术前2h各组血清AMY、ALB、P选择素、E选择素的水平差异无统计学意义，各组之间有可比性。造模后ANP组、GSNT组血清AMY、P选择素、E选择素浓度较SO组明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，临床工作中血清AMY升高常提示胰腺疾病，并且P选择素、E选择素在正常情况时低水平表达或不表达，而在急性炎症早期中性粒细胞向受损部位趋集过程中表达明显集中[18, 19]。因此，血清AMY、P选择素、E选择素水平的升高表明造模急性坏死性胰腺炎成功；术后ANP组与GSNT组各时间点AMY水平比较，差异无统计学意义，表明血清AMY水平与胰腺炎严重程度无关。ANP组、GSNT组术后血清ALB较SO组明显降低，且ANP组、GSNT组血清ALB水平均呈下降趋势，考虑其降低原因主要为ANP时因炎性反应周围组织大量渗出，肝脏合成减少，应激反应分解代谢增强；血清ALB水平可作为评估ANP严重程度及判断临床预后的指标，与ANP严重程度呈正相关。ANP组术后各时间点血清P选择素、E选择素水平均明显高于GSNT组，差异有统计学意义(P<0.05)。同时ANP组胰腺、肺病理评分明显高于GSNT组，光镜下可观察到ANP组胰腺、肺组织损伤情况较GSNT组明显。P选择素、E选择素的表达水平与细胞因子TNF-α的作用密切相关，离断内脏大神经可降低ANP炎性反应时血清TNF-α的浓度，这可能与离断内脏大神经后迷走神经相对兴奋有关[20]。迷走神经感觉纤维在炎性反应刺激下，将炎性反应信息经迷走神经传入支传入神经中枢，经中枢神经系统处理后，迷走神经传出支通过突触的方式释放乙酰胆碱可激活免疫细胞上胆碱能受体，降低TNF-α的浓度进而降低P选择素、E选择素表达水平，影响早期炎症发生、发展中炎性细胞黏附-损伤过程；同时，激活的胆碱能抗炎通路能快速直接调节全身性炎性反应，而起到抑制炎性反应减轻组织损伤的作用。

本研究显示，内脏大神经离断能降低犬ANP时血清中P选择素、E选择素水平，减轻胰腺以及肺组织损伤程度，证实胆碱能通路在炎性性疾病中具有重要调节作用。随着对ANP发病机制、神经抗炎机制认识的加深，进一步探讨并找到无创调节交感-迷走神经张力平衡的方法是治疗ANP时肺损伤的新方向。