任彦红 陈 丹 张广超 郭 青 沈照波 孙晓敏

肺炎支原体肺炎(mycoplasmapneumoniaepenumonia，MPP)是由于感染肺炎支原体(mycoplasmapneumoniae)导致儿童呼吸系统肺等产生炎症的一种常见非典型性肺炎。其中大多数支原体感染导致的肺炎病情较轻，对大环内酯类抗生素敏感，疗效好，但由于MP病原菌耐药性、多种病原混合感染和患儿免疫功能损伤等因素，导致某些支原体肺炎患儿较为难治[1]。流行病学研究表明，近年来儿童难治性肺炎支原体肺炎(refractory MPP，RMPP)在获得性肺炎病例中比例明显增高，其在儿童疾病中致死率也相对升高[2]。然而，关于RMPP的致病原因尚不完全明确，临床治疗显示在感染早期采用糖皮质激素进行治疗，有利于抑制MPP疾病进展，控制病情[3]。因此，尽早准确诊断对于及时进行治疗、减少RMPP发生、改善患儿预后具有重要临床意义。研究发现，血清中25羟维生素D[25-hydroxy vitamin D，25(OH)D]含量是衡量人体内维生素D水平的有效指标，一定程度上可反映人体免疫水平；甲壳质酶蛋白40(YKL-40)是巨噬细胞、血管平滑肌细胞等合成、释放的分泌型蛋白质，在机体处于炎症状态时其血浆水平升高，可反映机体炎症状态[4，5]。然而其在RMPP早期诊断中的作用尚不清楚。因此，本研究通过检测MPP患儿血清中25(OH)D、YKL-40水平并进行分析，旨在探究二者对儿童RMPP的早期诊断价值。

材料与方法

1.一般资料：选取2016年4月～2018年1月笔者医院收治的肺炎支原体肺炎患儿107例为研究对象，据RMPP诊断标准将MPP患儿分为普通支原体肺炎(ordinary MPP，OMPP)组67例，难治性支原体肺炎(RMPP)组40例。MPP诊断标准按照《实用儿科学》第7版相关诊断标准：患儿剧烈持续性咳嗽，胸片显示两肺有斑片或点网状阴影，白细胞计数正常或稍微偏高，大环内酯类抗菌药物对其治疗效果好，MP特异性抗体IgM呈阳性[6]。RMPP诊断标准根据《儿科难治性疾病管理指南》(2013年)中标准进行评定：采用大环内酯类抗菌药物正规治疗超过1周，咳嗽、发热等临床症状未减轻，呈进行性加重，肺外其他系统出现并发症，且胸片显示肺部阴影加剧的MPP患儿即可诊断为RMPP[7]。MPP患儿纳入标准：①符合MPP诊断标准且排除其他造成肺部感染病因的患儿；②患儿年龄5～12岁；③病程≤7天；④一般资料及病理资料完整患儿。排除标准：①合并其他病原菌感染患儿；②合并有反复呼吸道感染、先天性免疫缺陷疾病患儿；③病程超过7天患儿；④肺炎恢复期住院患儿；⑤中途未遵医嘱进行治疗患儿。选取同期与笔者医院门诊进行体检的健康儿童55例为对照组。本研究通过笔者医院道德伦理委员会批准并取得患儿家属知情同意。

2.临床资料收集：记录所有MPP患儿一般资料及临床资料，包括患儿年龄、性别、住院时病程、发热时间、肺外并发症、肺部啰音、呼吸音情况、胸腔积液情况、肺部坏死性炎症情况等资料。

3. 血清25(OH)D及YKL-40蛋白水平检测：于入院2h内采集所有MPP患儿静脉血(2毫升/人)，4℃下，3000r/min离心10min，收集上层血清，采用人25(OH)D ELISA试剂盒(货号：SBJ-H1130，南京森贝伽生物公司)、人YKL-40 ELISA试剂盒(货号：CSB-E13608h，武汉华美生物工程公司)检测各患儿血清中25(OH)D、YKL-40水平，具体步骤如下：①将特异性抗体球蛋白用包被缓冲液稀释至5μg/ml，每凹孔加0.4ml，4℃过夜；②缓冲液洗3次，加入0.2ml血清，37℃孵育60min；③缓冲液洗3次，加入酶标抗体anti-25(OH)D、anti-YKL-40，37℃孵育60min；④缓冲液洗3次后，加入0.2ml酶的作用底物，室温孵育30min；⑤加0.05ml柠檬酸(2mol/L)终止反应，检测492nm下吸光度(A)值。

结 果

1.MPP患儿与健康儿童血清25(OH)D、YKL-40水平的比较：与对照组健康儿童比较，MPP组支原体肺炎患儿血清中25(OH)D水平明显降低，YKL-40蛋白水平显著升高，差异有统计学意义(P<0.05),详见表1。

2.血清25(OH)D、YKL-40水平对MPP的诊断价值：ROC曲线分析显示，血清25(OH)D、YKL-40水平表现出对MPP患儿与健康儿童较强的区分能力。血清25(OH)D对MPP患者诊断的ROC曲线下面积为0.732，95%CI：0.679～0.881(P<0.05)，以21.09ng/ml为截断值诊断MPP敏感度为56.97%，特异性为82.86%，详见图1A；血清YKL-40对MPP患者诊断的ROC曲线下面积为0.679，95%CI：0.536～0.791(P<0.05)，以36.57ng/ml为截断值诊断MPP敏感度为50.79%，特异性为78.58%，详见图1B。

表1 MPP患儿与健康儿童血清25(OH)D、YKL-40水平的比较

图1 血清25(OH)D、YKL-40水平对MPP诊断的ROC曲线分析

3.血清25(OH)D、YKL-40水平与MPP患儿临床病理特征的关系：根据ROC曲线所取截断值将MPP患儿分为25(OH)D高水平组43例、25(OH)D低水平组64例和YKL-40高表达组62例、YKL-40低表达组45例。25(OH)D低水平者肺炎患儿肺部啰音、呼吸音低、胸腔积液、肺部坏死性炎症等发生率明显高于25(OH)D高水平者(P<0.05)；25(OH)D低水平者肺炎患儿的性别构成、年龄构成、发热时长、肺外并发症发生率与25(OH)D高水平者比较，差异无统计学意义(P>0.05)。YKL-40高表达者肺炎患儿中肺外并发症、肺部啰音、呼吸音低、胸腔积液、肺部坏死性炎症等发生率明显高于YKL-40低表达者，差异有统计学意义(P<0.05)；YKL-40高表达者肺炎患儿的性别构成、年龄构成、发热时长与YKL-40低表达者比较，差异无统计学意义(P>0.05),详见表2。

4.RMPP患儿与OMPP患儿血清25(OH)D、YKL-40水平比较：与OMPP组肺炎患儿比较，RMPP组患儿血清25(OH)D水平明显降低，YKL-40蛋白水平显著升高，差异有统计学意义(P<0.05),详见表3。

5.血清25(OH)D、YKL-40水平对RMPP的诊断价值：ROC曲线分析显示，血清25(OH)D、YKL-40水平表现出对RMPP患儿和OMPP患儿较强的区分能力。血清25(OH)D对MPP患者诊断的ROC曲线下面积为0.751，95%CI：0.614～0.877(P<0.05)，以18.57ng/ml为截断值诊断RMPP敏感度为55.95%，特异性为81.66%，详见图2A；血清YKL-40对MPP患者诊断的ROC曲线下面积为0.797，95%CI：0.683～0.954(P<0.05)，以38.59ng/ml为截断值诊断RMPP敏感度为63.76%，特异性为84.07%，详见图2B。

讨 论

RMPP一般指经大环内酯类抗生素治疗7天以上，未见明显疗效者，是MPP疾病中较为难治的一种。近年来，随着β内酰胺类抗生素的推广使用，儿童RMPP发生率逐年升高。RMPP疾病病程进展迅速，易引发肺坏死等严重肺内并发症，对患儿心脏、肝脏、脑等多器官造成损伤，导致多器官功能障碍，严重者进展为坏死性肺炎，甚至死亡[8]。研究发现，对早期RMPP患儿加用糖皮质激素进行治疗，可有效控制肺炎病情发展，改善患儿预后，治疗效果明显[3]。因此，探索与RMPP发生、发展相关的生物标志物，寻找敏感度、特异性较高的RMPP诊断生物标志物，可为早期精确诊断、后期靶向治疗及改善RMPP患者预后提供新思路。

表2 血清25(OH)D、YKL-40水平与MPP患儿临床病理特征的关系

表3 RMPP患儿与OMPP患儿血清25(OH)D、YKL-40水平比较

维生素是维持人和动物正常生理功能的一类微量有机物，自身不可合成产生，依靠从食物中摄取，在人体生长、发育及代谢等生物过程中具有重要作用[9]。其中维生素D是一类脂溶性固醇类维生素，其活性形式为1,25(OH)D半衰期很短，在人体血清中多以稳定的前提形式25(OH)D存在，一定程度上可反映人体维生素D状态[10]。邓永超等[11]研究发现，维生素D水平较低的儿童，免疫力较低，COX分析显示，维生素D水平较低是儿童发生肺炎的独立危险因素，重症肺炎患儿肺内皮细胞中25(OH)D水平显著低于轻症患儿，提示维生素D水平较低是影响肺炎由轻症进展为重症的因素之一。

Thuesen等[12]研究发现，25(OH)D低水平哮喘患者FEV1%等肺功能较低，提示25(OH)D与哮喘患者肺功能有关。另外，Rathored等[13]发现，耐多药性结核病患者血清25(OH)D水平显著低于普通结核患者。MPP发病的根本原因即在于机体免疫水平低，免疫系统不能成功抵御支原体病菌感染，因此本研究推测血清25(OH)D水平可能与MPP疾病发生有关。本研究发现，MPP患儿血清中25(OH)D水平明显低于健康儿童，表明25(OH)D水平较低可能是MPP疾病发生的原因之一。ROC曲线分析显示，血清25(OH)D对MPP患者诊断的AUC为0.732，表明血清25(OH)D水平对MPP患儿和健康儿童之间有较强的区分能力，提示检测儿童血清25(OH)D水平能较准确地诊断MPP疾病。进一步研究发现，血清25(OH)D水平与MPP患儿肺部啰音、呼吸音低、胸腔积液、肺部坏死性炎症发生率有关，提示25(OH)D可能参与MPP疾病进展。

图2 血清25(OH)D、YKL-40水平对RMPP诊断的ROC曲线分析

甲壳质酶蛋白40是一种由巨噬细胞、血管平滑肌细胞等合成、释放的分泌型蛋白质，因其N端起始氨基酸为酪氨酸(tyrosine，Y)、赖氨酸(lysine，K)和亮氨酸(leucine，L)而被称为YKL-40[14]。研究表明，机体中YKL-40过表达在多种炎症相关疾病发生、发展中具有重要作用，参与调解炎性相关因子表达、细胞增殖、组织重塑等生理病理过程[15]。Corradi等[16]发现，非小细胞肺癌患者血清YKL-40浓度显著升高，检测血清YKL-40水平可显著提高肺癌的诊断特异性。Korthagen等[17]发现，循环YKL-40水平在纤维性间质性肺炎中显著升高，与纤维化程度和炎症的活动程度有关，提示血清YKL-40水平可能与肺部病变的发生、发展有关，但YKL-40在MPP疾病中作用尚不清楚。本研究发现，MPP患儿血清中YKL-40蛋白水平显著高于健康儿童，血清YKL-40对MPP患者诊断的AUC为0.679，表明血清YKL-40蛋白水平对MPP患儿和健康儿童之间有一定区分能力，提示检测儿童血清25(OH)D水平可能较准确地诊断MPP疾病。进一步研究发现，血清YKL-40蛋白水平与MPP患儿肺外并发症、肺部啰音、呼吸音低、胸腔积液、肺部坏死性炎症发生率有关，表明血清YKL-40蛋白水平与MPP疾病严重程度有关，提示YKL-40参与MPP疾病进展。

根据RMPP诊断标准，可将MPP患儿分为OMPP患儿和RMPP患儿，其中RMPP患儿常常伴随肺内及肺外多脏器并发症，导致多器官衰竭，病死率更高，治疗的重点在于早期糖皮质激素药物的介入处理和感染的及时有效控制[18]。因此，RMPP的准确诊断有利于区分OMPP和RMPP患者，从而尽早给与合理干预，控制患儿病情进程，改善预后。本研究发现与OMPP组肺炎患儿比较，RMPP组患儿血清25(OH)D水平明显降低，YKL-40蛋白水平显著升高，表明25(OH)D、YKL-40可能与RMPP发生相关。ROC曲线分析发现，血清25(OH)D、YKL-40水平表现出对RMPP患儿和OMPP患儿较强的区分能力，且血清25(OH)D对MPP患者诊断的AUC为0.751，血清YKL-40对MPP患者诊断的AUC为0.797，敏感度及特异性较高，提示检测MPP患者血清25(OH)D、YKL-40水平可用于RMPP的初步诊断，且血清YKL-40水平对RMPP的诊断价值更高。然而25(OH)D、YKL-40在MPP疾病发生、发展中作用机制仍不明确，将在后续研究中进行探究。

综上所述，MPP患者血清25(OH)D水平较低，YKL-40水平较高，二者对MPP具有较高诊断价值，且在OMPP患儿和RMPP患儿中呈现显著差异，对RMPP的诊断具有一定价值，推测检测血清25(OH)D、YKL-40水平可能应用于RMPP的诊断和早期筛查。