王 帅 葛俊杰 耿 晓 崔 文 周成军

甲状腺癌是最常见的内分泌恶性肿瘤，发生率近10年显著增高。甲状腺乳头状癌在甲状腺癌中最为常见，占80%～85%[1]。流行病学调查显示，肥胖是恶性肿瘤发生的危险因素。有学者对肥胖与甲状腺癌的关系进行了研究，结果显示在肥胖人群中甲状腺癌发生率更高[2]。并有研究报道血清瘦素水平与体重呈正相关[3]。瘦素是研究最多的脂肪因子之一，是由肥胖基因(ob)编码的蛋白类激素。可以通过调节体内脂肪储存来调节体重，并且对于食物摄取与能量平衡、新陈代谢、神经内分泌也有调节作用[4]。本研究对瘦素与人甲状腺乳头状癌K1细胞的关系进行实验，研究瘦素对K1细胞功能的调控。

材料与方法

1.材料 ：人甲状腺乳头状癌细胞系(K1)购于欧洲细胞库(英国ECACC公司)。DMEM培养基购自中国Fisher公司，胎牛血清(FCS)购自杭州四季青公司，MTT购自美国Sigma公司，Transwell小室购自美国Costar公司。

2.方法：(1)细胞培养使用含有10%胎牛血清DMEM培养基，将培养瓶放于37℃、5% CO2培养箱中培养。在倒置显微镜下观察细胞融合至80%时，1∶2传代。(2)MTT实验:取对数生长期的K1细胞，按5×103个/孔接种于96孔板中。接种第2天换DMEM无血清培养液，每孔加入100μl。第3天同一时间，配置好不同浓度的瘦素，实验设置0ng/ml(空白对照组)、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、125ng/ml 5个组，每组设置3个复孔。分别在加药后的24h和48h加入25μl MTT溶液，2h后加入100μl Lysis buffer溶液，过夜(超过12h)后测吸光度值(波长为570nm)，以上实验重复3次，取平均值。(3)划痕实验:将K1细胞以每孔1×106个细胞接种于6孔板中。第2天长满后用200μl的枪头比对直尺垂直划痕。每孔划痕3道垂直线。划痕后使用PBS冲洗细胞2次。用配制好的不同浓度瘦素给予刺激(0ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、125ng/ml)。分别在0、24和48h置于荧光倒置显微镜下拍照。计算得出细胞迁移率[细胞迁移率(%)=(修复前划痕内面面积-修复后划痕内面面积)/修复前划痕内面面积×100%]。以上实验重复3次，取平均值。(4)Transwell实验:用30μl 1∶6稀释的Matrigel胶铺于Transwell小室上层，2h后加100μl DMEM培养基水化，上室加入用不同浓度瘦素预先处理过的细胞2×105个，下室加入500μl含10%FBS的培养基，每组设3个复孔。放置培养箱中培养72h。72h后取出小室，PBS清洗3遍，棉签轻轻擦去上室内细胞，无水甲醇固定30min，0.5%的结晶紫染色30min，PBS清洗3次，自然风干，每个浓度组在正置显微镜下取5个视野拍照。以上实验重复3次，取平均值。

结 果

1.MTT实验检测K1细胞增殖：5组不同浓度瘦素处理K1细胞后，用MTT法连续观察K1细胞在24h和48h增殖情况，检测波长570nm处的吸光度(A)值，运用ANOVA法计算出数据(表1)。结果显示相同时间下不同波度组的瘦素对K1细胞的增殖并无影响，差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 不同浓度瘦素影响K1细胞增殖

2.划痕实验检测K1细胞迁移：0ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml和125ng/ml不同浓度瘦素组24h K1细胞迁移率分别为40.201%、47.383%、59.950%、68.732%、79.306%；48h细胞迁移率分别为49.398%、74.192%、86.733%、87.795%、90.005%。随着瘦素浓度逐渐升高，划痕内面面积缩小，迁移率升高；随着瘦素处理时间延长，划痕内面面积缩小，迁移率升高。K1细胞表现出与瘦素的时间依赖性与浓度依赖性的特点。24h与48h迁移率比较，差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 各浓度瘦素处理K1细胞后迁移率分析(%)

3.Transwell实验检测K1细胞侵袭：显微镜下计数0ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml和125ng/ml 5个浓度组的K1细胞穿出聚碳酸酯膜个数分别为63±3、97±7、126±6、140±1、180±2个(图2)。穿出聚碳酸酯膜的细胞个数与瘦素浓度呈正比。随着瘦素浓度增加，K1细胞侵袭能力增强，说明瘦素对K1细胞侵袭能力有促进作用，差异有统计学意义(P=0.000)。

图1 各浓度瘦素处理K1细胞后划痕实验图片(×100，荧光倒置显微镜)

图2 不同浓度瘦素处理K1细胞侵袭性比较(结晶紫染色，×100)A.0ng/ml;B.10ng/ml;C.50ng/ml;D.100ng/ml;E.125ng/ml

甲状腺癌是目前增长最快的恶性肿瘤，排名第6位[5, 6]。甲状腺癌有4种分型，即甲状腺乳头状癌(PTC)、滤泡型甲状腺癌(FTC)、低分化癌(PDTC)和未分化癌(ATC)。2014年美国诊断病例为62980例，其中90%为甲状腺乳头状癌(PTC)[7]。未分化的甲状腺癌由于远处转移和缺乏有效治疗，10年生存率<10%[8]。随着多种诊断技术和诊断方法的增加，甲状腺癌的检出率也逐渐增高，甲状腺癌早期多无明显症状，多在健康体检中发现有占位性病变。另外CT、MRI扫描、生化标志物等多种诊断技术的使用增多也使甲状腺癌的检出率增高[9]。

根据流行病学调查显示，肥胖已经成为全球性疾病，并且与许多疾病息息相关，也是致癌的危险因素之一。脂肪组织不仅可以储存能量，还能分泌细胞因子和激素，如脂联素(adiponectin)、瘦素(leptin)、内脏脂肪素(visfatin)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)等。虽然与肥胖发生的相关分子机制尚未完全明确，但是基因起到决定性因素，最主要的基因是肥胖(Ob)基因和Ob受体(Ob-R)基因。瘦素与其受体结合后激活PI3K、ERK1/2、STAT3条通路，从而促进肿瘤细胞的增殖，并且当瘦素受体相对缺乏时，可影响ERK1/2和(JAK2)/ STAT3信号转导[10，11]。

瘦素是由Ob基因编码的由167个氨基酸组成的蛋白质入血后去除N末端的21个氨基酸信号序列后，形成含有146个氨基酸的蛋白类激素[12]。大多数瘦素主要分布在白色脂肪，血循环中瘦素浓度测定直接与人体白色脂肪的总量呈正比。健康人群中瘦素的含量是5～10ng/ml,肥胖人群中瘦素含量是40～100ng/ml[13]。

Rehem等[14]研究了高分化甲状腺癌与血清瘦素的关系，采集30例高分化甲状腺癌患者与30例甲状腺良性结节患者术前和术后1个月的血样，分析血清瘦素的变化，得出血清瘦素水平比对照组高且术后下降，这一现象说明瘦素在诊断甲状腺癌中起到重要作用。Hedayati等[15]选取83例甲状腺乳头状癌PTC患者(35例男性、48例女性)和90名健康者(40名男性、50名女性)，年龄、性别、BMI均互相匹配。采集血样测定血清瘦素后比较含量，并测量身高、体重、计算BMI。实验分析患病组比正常组血清瘦素水平高，说明瘦素与PTC有相关性；女性比男性瘦素水平高，说明体内的脂肪含量与瘦素水平呈正比(女性体内脂肪含量高于男性)。Fan等[16]探讨了瘦素及其受体在甲状腺癌预后中的潜在意义，选取173例甲状腺癌患者，得出瘦素及其受体的表达与PTC有相关性，并且会引起患者预后不良。

本实验选取了脂肪因子中的瘦素进行细胞实验，MTT实验结果显示瘦素并不影响细胞的增殖(P>0.05)。体内的肿瘤细胞能够大量增殖可能与癌细胞远处转移这一特性有关，从而促进了癌细胞的大量增殖[17]。在本实验中癌细胞增殖不受影响，或许是因为细胞模型的局限性所致。另外的一个原因或许是因为瘦素抵抗现象，即瘦素受体具有饱和性，从而导致浓度过高的瘦素因为瘦素受体的这一特性不能完全发挥作用。也或许是瘦素仅仅是在患癌的起始阶段起了一定的作用，体内过高浓度的瘦素只起到致癌的作用，而并不能促进癌细胞生长。中国台北地区Mackay Memorial医院的Cheng等[17]研究了瘦素对K1细胞的迁移能力，研究发现高浓度瘦素能够提高其迁移性[17]。本实验用不同浓度的瘦素处理K1细胞后划痕实验也得出瘦素能够促进K1细胞的迁移。肿瘤细胞穿过基膜是肿瘤细胞是否转移的关键一步，建立体外侵袭实验的细胞模型模拟肿瘤细胞在体内侵袭的生理过程，本实验结果显示瘦素促进甲状腺癌细胞的侵袭，并且随瘦素浓度的增加侵袭性增强。本实验初步探讨了瘦素对于甲状腺癌侵袭的影响，机制还尚不完全清楚，在下一步实验中还需进一步研究哪个信号通路在这一过程中起作用。

综上所述，对甲状腺癌的诊断除其他的特定肿瘤标志物外，瘦素还可作为一个相关肽辅助诊断。在临床甲状腺癌治疗中，瘦素或许可以作为一个基因治疗的靶点或是一种新药起到临床治疗作用。