袁玉娟 尼菲拉·甫拉缇 依力哈木·阿布力提甫 穆叶赛·尼加提

随着人们生活水平的提高、饮食结构的改变，心血管疾病在发展中国家也有明显的增长趋势，专家们推测2020年它将成为世界头号杀手[1]。缺血性心脏病中致死性最强的急性冠状动脉综合征(acute coronary syndrome,ACS)，发生率呈逐年增加趋势[2]。

ACS 是指冠心病中急性发病的临床类型，以急性心肌缺血为共同特征的一组临床综合征，其包括急性心肌梗死(AMI)和不稳定型心绞痛(UAP)患者。ACS 的发病急、病情重、病死率高，1/2的心血管死亡原因归结为ACS，因而需要早期预防、诊断和治疗。随着冠脉血管血运重建技术逐渐普及与成熟，以及多种抗血小板及抗凝药物的联合使用大大降低了ACS患者发生急性血栓事件的概率，但是粥样硬化斑块基础上形成血栓的分子生物学机制仍不清楚。

近年来研究发现，血栓的形成不仅与血小板、内皮细胞、组织因子(TF)有关，动脉粥样硬化病灶局部及斑块发生破裂的冠状动脉局部血液中存在促凝血活性的微粒，是由细胞内吞作用形成的管腔内磷脂囊泡，其直径为0.1～1.0μm，来源包括血小板、红细胞和内皮细胞等，数量完全取决于细胞的激活或者凋亡[3～6]。现在越来越多的研究证明微粒可作为很多系统疾病诊断及治疗的生物标志物，包括心血管系统疾病、神经系统疾病和肿瘤疾病[7～10]。

前期研究发现 ACS 患者的外周血微粒水平明显升高，其中红细胞源微粒、血小板源微粒以及内皮细胞源微粒参与了 ACS 的发生、发展过程。笔者在体外将 ACS 患者血浆中提取的不同浓度红细胞源微粒和血小板源微粒加入非冠心病患者血浆中，发现微粒诱导血栓形成的峰值前移，提示红细胞源微粒和血小板源微粒可能诱导凝血酶形成，从而证实 ACS 发生急性血栓与红细胞源、血小板微粒相关性[11～15]。

代谢组学是一个新的系统生物学方法，补充了基因组学、转录组学和蛋白质组学，是细胞系统中代谢物集合的综合分析，已被用于发现疾病诊断或预后的生物标志物，并揭示与疾病发病机制相关的机制[16]。结合代谢组学分析 ACS 的发病机制，为进一步研究血栓形成过程中微粒内物质变化提供新的窗口[17]。

本研究通过质谱仪同时检测ACS和非冠心病组正外周血物质代谢和微粒内物质代谢，分析两组外周血、微粒内差异性物质代谢物质和代谢通路，同时证明 ACS 患者微粒内代谢成份、代谢通路不同于外周血成分代谢。

对象与方法

1.样本来源：所有纳入对象均来自2016年9月～2017年2月在新疆维吾尔自治区人民医院心内科住院的患者。根据严格的纳入标准和排除标准最终从126例住院患者筛选出25例纳入研究，所有患者入院时告知研究内容并同时签署知情同意书。研究对象分为ACS组(n=15)，其中男性10例，女性5例；高血压病9例，糖尿病5例，吸烟5例，Non-CAD组(n=9)，其中男性5例，女性4例；高血压病4例，糖尿病2例，吸烟3例，为了收集研究对象的一般资料和心血管疾病相关危险因素，制定了一份详细的调查问卷。调查问卷主要包括一般个人信息、职业、家族历史、吸烟状况和饮酒。体格检查包含血压、心率、心电图(ECG)、身高、体重、腰围、腹部围和臀围测量，同时完善患者临床相关生化指标。

2.纳入及排除标准：所有入选患者均经冠状动脉造影证实冠状动脉病变情况，冠状动脉造影未见异常者视为非冠心病患者，纳入非冠心病组。

诊断标准：①不稳定型心绞痛诊断标准是基于以前的研究：最近的1个月内新发生的心绞痛,或1个月内心绞痛恶化(心绞痛的分级增加了至少1级,或者达到3级,根据CCS评分,或在休息时出现心绞痛。心电图显示出至少两个相邻导联出现新的或动态变化的ST段或T波,而肌钙蛋白T(cTnT)的检查结果是正常；②急性心肌梗死(AMI)为胸痛持续时间>20min，AMI患者的心电图显示海拔或抑郁的ST段,在24h内至少两个相邻导联出现ST段的抬高或压低，其抬高者为STEMI，未抬高者为Non-STEMI,同时cTnT>0.1μg/L(正常价值<0.05μg/L)。

排除标准：①严重肝肾功能不全；②肿瘤性疾病；③造血系统疾病；④类风湿、系统性红斑狼疮和干燥综合征；⑤脑梗死和肺栓塞。

3.样本收集：为避免冠状动脉造影及相关介入治疗影响外周血微粒的水平，所有患者均在冠状动脉造影前进行外周血采集用来检测代谢物质。标本为入院24h之内患者的外周血，获得知情同意书后，采集患者肘静脉血2ml，血常规、血脂等检测均在清晨空腹静息状态下抽取外周血送检。用柠檬酸钠抗凝管(美国BD公司)收集。在血液取样时保证止血带不应该保持太长时间，从而避免诱导细胞的激活或凋亡。

4.一般项目和生化指标：收集所有研究对象的一般资料，包括姓名、性别、年龄、吸烟(吸烟详细记载吸烟年数，每天吸烟支数)、饮酒；高血压病、2型糖尿病、服药史等。生化指标包括总胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglycerid，TG)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein，HDL)、脂蛋白a、白蛋白、白细胞计数、红细胞计数、血红蛋白、血肌酐、心脏射血分数(LVEF%)。

5.质谱条件:UPLC质谱串联LTQ-Orbitrap velos (Thermo Fisher Scientific, SanJose, CA, USA)质谱，采用电喷雾离子源正离子模式；鞘气为氮气和辅助气，流速分别为45个任意单位 (arbitrary units) 和10个任意单位 (arbitrary units)；质谱扫描范围为100～1000m/z； 喷雾电压设为4.2kV；离子传输管温度350℃，数据采用高分辨傅里叶转换模式(FT)获取，一级分辨率为60000； 二级分辨率为15000；二级采用数据依赖(data-dependent)分析模式； 动态排除时间为15s；碎裂方式选择HCD，相关参数设置如下：隔离宽度为3Da；碰撞能量：根据不同代谢物选择20%、40%和60%； 启动时间为30ms；

6.液相条件：采用Waters H-class 型号超高效液相色谱对样品进行分离。分析条件如下：色谱柱：waters BEH C18 (3.0mm×100.0mm, 1.7μm),柱温 50℃；流动相A 为0.1%甲酸水，流动相B为乙腈。(1)外周血清分析梯度为：0～2min，2%B; 2～15min, 2%B～98%B; 15.0～15.1min, 98%B～100%B;15.1～25.0min, 100%B; 25.0～25.1min, 100%B～2%B; 25.1～30.0min，2%B；流速为0.3ml/min；进样体积为5μl。(2)微粒分析梯度：0～2min，2%B; 2～15min, 2%B～98%B; 15.0～15.1min, 98%B～100% B; 15.1～25.0min, 100%B; 25.0～25.1min, 100%B～2%B; 25.1～30.0min，2%B；流速为0.3ml/min；进样体积为5μl。

7.样本制备：外周血标本收集于带有3.28%柠檬酸钠(1∶9)的抗凝管，混匀后离心。(1)外周血标本：在3500×g、室温下离心10min离出血细胞，获得血清，标明收集日期以及患者入组编号于-80℃保存以便将来使用。血清在室温下溶解，取样 50μl， 加150μl 水，混匀，加400μl乙腈，混匀，4度静置1h， 14000×g离心10min，取上清500μl, 离心浓缩，用200μl 2%乙腈水复溶，14000×g离心10min，取5μl进样。(2)微粒：血标本以3500×g、室温下离心10min离出血细胞，其上清在20000×g15min 4℃离心获得微粒标本，微粒在室温下溶解，放入-20℃冰箱冷却30s，后放入37℃超声清洗仪内超声打碎90s，加入200μl甲醇溶液，涡旋30s，超声机2个循环，共20min以裂解微粒，放入4℃冰箱冷却20min，14000×g10min 4℃离心，取上清，离心浓缩仪吹干(2～3h)，用20μl 2%乙腈水复溶，涡旋30s，37℃水浴30s，14000×g10min 4℃ 离心后进样。

8.统计学方法：由UPLC-LTQ orbitrap 获得的原始数据，采用美国Waters 公司的商业组学分析软件progenesis QI (Version 2.0, Nonlinear Dynamics, UK)软件进行处理。该软件可自动完成峰对齐，峰识别和峰校正等前处理程序，最终输出三维矩阵，即由保留时间和精确质荷比组成的谱峰索引变量、样本名称和峰强度/面积组成。获得的数据矩阵导入多变量统计软件SIMCA-P software 14.0 (Umetrics AB, Umea, Sweden)进行PCA 分析，可视化组间变化趋势。组间差异变量通过OPLS-DA模型获取的VIP 值进行筛选，VIP值>1的变量认为是组间显著性差异变量。将鉴定得到的差异性变量进行代谢通路分析, 分析与疾病相关性较强的代谢通路。定量资料进行正态性检验，符合正态分布资料以平均值±标准差表示，两组之间采用t检验；不满足参数检验条件的资料，以中位数(四分位数间距)来表示，采用秩和检验。

结 果

1.ACS组和Non-CAD组临床基本信息和临床生化指标资料:两组患者在BMI、性别、是否合并糖尿病、是否合并高血压病、是否吸烟方面比较，差异无统计学意义(P>0.05)，说明两组间临床基本信息具有可比性，两组年龄比较，差异有统计学意义(表1)。

表1 ACS组与Non-CAD组临床基本信息的比较

ACS组和Non-CAD组临床生化指标情况:ACS组和Non-CAD组在外周血总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、脂蛋白a、红细胞计数、血红蛋白、血肌酐、白蛋白等方面比较差异无统计学意义(P>0.05)，白细胞计数、心脏射血分数(LVEF)两组之间比较差异有统计学意义，说明两组间除白细胞计数和LVEF，其余临床生化指标具有可比性(表2)。提取微粒后使用电子显微镜证实微粒形态结构(图1)。

2.外周血实验结果:ACS组和Non-CAD组PCA趋势分析：由图2所见，ACS组和Non-CAD组具有显著的代谢差异,质控样本重复性良好。

OPLS-DA模型及差异代谢物分析：采用OPLS-DA模型对变量进行聚类，筛选对聚类贡献较大的变量。结果显示，模型不存在过拟合，在可以接受的范围内。根据OPLS-DA模型，筛选对分类贡献较大的变量(VIP>1.5，图3,图4)。

结合t检验得到两组中具有显著差异的变量，取交集得到差异变量81个(图5)。对差异变量进行初步鉴定，根据精确分子量以及部分代谢物的二级碎片预测得到差异变量的候选代谢物，对代谢物进行通路分析，主要参与的代谢通路有磷脂代谢、鞘脂代谢、亚油酸代谢、酮体的合成与降解(图6)。

3.微粒实验结果：ACS组vs非冠心病组 PCA趋势分析,PCA得分图显示，疾病组和正常组具有一定的代谢差异，质控样本重复性良好(图7)。

表2 ACS组与Non-CAD组临床生化指标比较中位数(四分位数间距)]

图1 ACS 外周血电子显微镜下微粒

图2 PCA得分图

OPLSDA模型及差异代谢物分析，采用OPLSDA模型对变量进行聚类，筛选对聚类贡献较大的变量。结果显示，模型不存在过拟合，在可以接受的范围内。根据OPLS-DA模型，筛选对分类贡献较大的变量(VIP>1.5，图8,图9)

图3 OPLS-DA得分图和模型的置换检验

图4 变量VIP 分布

图5 结合VIP和t检验交集的差异变量

图6 代谢物参与通路权重图

图7 PCA得分图

结合t检验得到两组中具有显著差异的变量，取交集得到差异变量31个。对差异变量进行初步鉴定,根据精确分子量以及部分代谢物的二级碎片预测得到差异变量代谢物，主要参与的代谢通路有淀粉蔗糖代谢和戊糖、葡萄糖醛酸酶转换(表3)。

讨 论

据统计全球每年有上千万人死于心血管疾病，其中一半以上死亡原因为急性心肌梗死，这就需要临床能早期诊断和早期发现这类高危人群，进行早期临床干预，降低这类疾病的发生率和病死率[18]。ACS的诊断基于临床症状的评估、体表心电图以及生物标志物的综合分析[19]。在缺乏典型的心电图变化时，临床上使用生物标志物识别缺血症状对于ACS临床诊断和危险分层至关重要。

图8 OPLSDA得分图和模型的置换检验

图9 变量VIP 分布

化合物化合物 ID名称化学式积分碎片分数6.95_461.0566m/zHMDB596488-oxo-dGDPC10H15N5O11P238.08.617.35_833.4594m/zHMDB38350果胶糖苷C43H70O1434.722.007.64_310.0449m/zHMDB34043三氯氰菊酯C15H11O6+45.934.908.30_372.2714m/zHMDB1019911b-PGF2αC20H34O534.37.568.53_625.3404nHMDB02579糖昔脱氧胆酸3-葡糖苷酸C32H51NO1141.631.60

微粒不同于从凋亡细胞中释放的直径超过1μm的凋亡体，也不同于由细胞活化所释放的直径大约10.0～100.0nm的外泌体。目前研究证实微粒不仅仅是简单的细胞膜脱落物，而且是携带其来源细胞的多种生物学信息，具有多种重要的生物活性分子的载体。近年来研究认为微粒作为特定的外源凝集素和细胞因子的介质，能促进细胞间的相互作用和细胞传递，被看作是细胞间信息传递的新路径[20]。此外,微粒还携带有来源细胞的各种生物活性分子，如细胞因子、RNA和DNA，通过转移这些生物活性分子致靶细胞，调节一系列生物效应[21,22]。现在越来越多的医学证明，微粒可作为很多系统疾病的诊断及治疗的生物标志物，包括心血管系统疾病、神经系统疾病和肿瘤疾病[23]。微粒不仅能反映细胞的激活状态，也能反映炎性进展和高凝状态的特征。因此，微粒被公认为许多凝血和炎性疾病的关键因素。

代谢水平的改变能更快地反映生理水平的改变，它能代表疾病表型。代谢组学允许多变量的定量测定，反应代谢组学病理生理激活，没有针对性的代谢组学方法主要涉及大量代谢物的客观的分析，这种方法提供了更大范围的代谢物，通常这是生物标志物发现过程的初始阶段，后来通过其他有针对性的分析方法得到进一步证实。

近年来对冠心病、急性心肌梗死的代谢组学研究引起了国内外广泛关注，事实证明血浆中的代谢物在疾病的预测、诊断、治疗中起着重要的作用，有助于急性冠脉综合征的早期发现，积极进行干预治疗，并很大程度上降低心血管恶性事件的发生。Ali等发现STEMI、UA和正常组的外周血中共有68种代谢物，健康者与STEMI患者相比，其主要峰值差异为H2S、甘油、乳酸、尿酸和脂肪酸。另有研究发现在稳定型心绞痛和AMI之间的代谢组学有明显的差异，有变化的代谢物包括磷脂、脂肪酸、神经鞘脂、甘油脂和类固醇，这些血清中鉴别性代谢物的发现对疾病发病机理的洞察提供了更多依据。Carlos等比较非ST段抬高ACS患者和健康对照的外周血浆，鉴定出两组间有15种代谢产物具有差异，反映了心肌细胞遭受氧化应激和缺氧状态时动脉粥样硬化过程的代谢组学特征，有助于更好的解释心脏细胞中发生的变化。然而，对于急性心肌梗死患者外周血中微粒的代谢组学研究尚未见相关文献报道。代谢物分析技术可以为疾病发生、发展过程提供一个详细的代谢过程图。因此，这将为发现预测生物标志物从而更早的进行临床治疗的干预提供机会。

本研究外周血代谢组学结果显示差异变量81个，对差异变量进行初步鉴定，根据精确分子量以及部分代谢物的二级碎片预测得到差异变量的候选代谢物，对代谢物进行通路分析，主要参与的代谢通路有磷脂代谢，鞘脂代谢，亚油酸代谢，酮体的合成与降解等。ACS患者的外周血微粒代谢物鉴定显示无数种不同程度发生的代谢物，其主要的代谢途径主要有淀粉蔗糖代谢和戊糖、葡萄糖醛酸酶转换途径的改变。

酮体水平升高是一个常见的代谢区域，也可能与能量代谢有关。脂肪酸氧化，在葡萄糖和脂质代谢中的作用已经明确。在饥饿或糖尿病的情况下，由于高水平的脂肪酸和低胰岛素，酮体的水平显着增加，在这种情况下，它们成为心肌的主要能量供应。本研究结果提示缺氧情况“模拟”糖尿病发生的生理状况，葡萄糖代谢的低能量产量迫使细胞使用脂肪作为能量来释放酮体作为最终物质。β-羟基丁酸酯和丙酮都是主要合成的酮体。

笔者认为，这些代谢变化可能对MI患者的早期风险分层有用，特别是当患者入院时肌钙蛋白结果为阴性，如ACS患者观察到上述差异性代谢物和代谢途径，能够分配不同的相关代谢簇。笔者尝试建立的特异性代谢预测生物标志物预测心肌损伤，从而允许能早期干预和(或)寻找更显著治疗方法，这就需要开展更大的样本量和多中心的随机对照研究进一步证实。