罗廷泽 邱 超 夏 琰 程晓松 张 波 许硕贵

中小血管吻合技术涉及手足外科、头颈外科、颌面外科、整形外科、血管外科，是断肢(指、趾)再植、离断血管修复的关键技术、更是游离组织瓣修复重建成败的决定技术。一直以来，为了能够寻找到一种吻合速度迅速、吻合通畅率良好、且能满足血管生理与生物力学要求的理想方法，研究者进行了很多尝试，但迄今尚未取得突破性进展[1]。小血管吻合口失败研究者主要原因是吻合口的狭窄，而吻合口狭窄的主要原因是血管壁对其损伤的反应性重构及内膜增生(vascular intimal hyperplasia, VIH)[2,3]。为防止血管吻合后再狭窄，许多研究者进行了微小血管无缝线吻合法的研究，无缝线吻合法避免了针线对血管壁的全层针刺损伤和缝线拖拉损伤，可以从根源上解决微小血管吻合后再狭窄的问题。但目前报道的各类无缝线吻合法都有各自的不足之处。为此本课题组发明了一种可吸收形状记忆套管材料用于微小血管的无缝线吻合，并进行了动物实验。

可吸收形状记忆套管材料为课题组发明(图1，直径5mm)，主要成分为聚己内酯，为美国FDA批准临床使用材料，添加的辅料偶联剂为烃氧基硅烷[4，5]。多官能团单体选自含2～3个烯键的有机酯，如季戊四醇三烯酸酯等。填料选自含有活性钙离子的化合物，如磷酸氢钙等，均为生物相容性良好，且可吸收的材料。利用放射性交联技术制备的形状记忆套管用温生理盐水(50℃)加热后可收缩至原来形状(直径1.2～2.5mm)。

图1 可吸收形状记忆套管

材料与方法

1.血管吻合动物模型的建立:以SD大鼠为实验对象，分别建立实验组(可吸收形状记忆套管系统组)和对照组(传统缝线组)动物模型，每组分别行端-端吻合。(1)实验动物：雄性SD大鼠60只，体质量：300～350g，由第二军医大学动物实验中心提供。实验动物许可证号：SYXK(沪)2017-0004。(2)微血管吻合术：用1%利多卡因经腹腔注射麻醉大鼠后，腹部备皮后碘伏消毒术区2次，在外科显微镜下通过腹部正中切口分离主动脉(每组30个)，以1%的利多卡因冲洗术野防止血管痉挛，夹闭动脉，切断，并用含肝素的盐水冲洗动脉。(3)实验组行可吸收形状记忆套管配合医用Histoacry®组织胶水吻合：①用形状记忆套管材料(直径5mm，长度4mm)套于近端断裂血管外面，套管的一边对齐近心端血管断裂口，将一根直径适宜的克氏针的钝性端插入近端心血管腔内4～6mm，暂时性支撑血管防止血管壁塌陷，用少量温生理盐水(50℃)加温，形状记忆套管回缩至原直径形状(原直径接近血管腔直径1.2～1.6mm)，套管此时贴近血管外壁，并具有一定的韧性从而为提供血管壁支撑力，用Histoacry®组织胶水将套管与血管外壁粘合，取走血管腔内克氏针，套管材料可支撑近心端断裂口处血管腔；②采用上述同样方法准备好远心端血管断裂口，并再套一个未收缩的套管材料(直径5mm，长度4mm)于远心端血管外；③分别用镊子夹持被形状记忆套管支撑好的两个断裂口并对齐，用Histoacry®组织胶水均匀涂抹并粘合；④将远端未收缩的套管移动至吻合口，用少量温生理盐水(50℃)加温，形状记忆套管回缩至原来直径形状，覆盖于断裂吻合口位置。模拟图和动物实验手术图分别见图2和图3。(4)对照组行传统缝线吻合：以8-0无损伤线行8～12 针的间断吻合。记录手术中其每个吻合口的吻合时间及吻合口通畅情况。

图2 利用可吸收形状记忆套管行血管端端吻合的模拟示意图

图3 利用可吸收形状记忆套管行大鼠腹主动脉端端吻合的手术过程

2.组织学检测:(1)HE染色:收集术后1周、6周的吻合血管，用4%多聚甲醛固定组织样本，石蜡包埋，纵向剖开血管腔做7μm厚的切片，经HE染色后，在显微镜下观察吻合口管腔直径、异物反应、内皮增生程度及周围的炎性细胞并记录每高倍视野下炎性细胞数量。(2)CD68染色：收集术后6周实验组及缝合组血管的吻合口组织，4%多聚甲醛固定后，做7μm厚的纵向血管切片，按照CD68抗体免疫组化试剂盒说明书进行染色，并在显微镜下观察CD68阳性细胞并记录每高倍视野下阳性细胞数量。

3.影像学检测：(1)血管造影(CTA)：术后6周，经大鼠颈静脉插管注入造影剂，行大鼠腹主动脉的CTA检测，评估实验组及对照组血管通畅性。(2)血管彩超检测：在术后6周利用多普勒超声经大鼠腹部测量血管吻合口周围官腔直径及血流量。(3)扫描电镜(SEM):取术后6个月吻合血管，纵向剖开官腔，经4%多聚甲醛固定后，利用扫描电镜观察血管内皮愈合情况。

4.统计学方法：采用SPSS 21.0统计学软件对数据进行统计分析，组间进行配对t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.血管吻合模型建立及吻合时间、通畅率:利用可吸收形状记忆套管成功实现了血管断端的吻合，实验组30只大鼠吻合血管所需平均时间为13min，而传统缝合法所需平均时间为55min(图4)，且实验组和缝合组的即时通畅率比较，差异无统计学意义(图5)，表明这种新型吻合方法是一种可靠且省时的吻合方法。

2.吻合口HE染色:通过观察术后6周及6月吻合口周围的组织可以看出，缝合组与实验组比较(图6)，吻合口周围有大量炎性细胞增生，且缝合组有较多的巨噬细胞存在。通过术后1周、6周、6个月缝线吻合法与新型无缝线吻合法吻合口周围每高倍视野的炎性细胞计数(图7)，术后6周及6个月时无缝线组吻合口周围的炎性细胞数明显少于缝线组。

图4 新型无缝线吻合法与传统缝线吻合法行血管端端吻合术时吻合时间的比较

图5 新型无缝线吻合法与传统缝线吻合法行血管端端吻合术后血管即时通畅率的比较

图6 吻合口组织HE染色(×50)

图7 术后1周、6周、6个月缝线吻合法与新型无缝线吻合法吻合口周围每高倍视野的炎性细胞计数

3.吻合口周围免疫组化检测：通过对术后6周缝线吻合组(图8B)与无缝线组(图8A)吻合口组织免疫组化染色，表明缝线组比无缝线组引起了更多CD68+细胞的表达(P<0.05)。通过在高倍视野下的细胞计数，缝合组每高倍视野下CD68+细胞数为78±10个，而实验组仅为30±4个(图8)。

图8 术后6周吻合口组织免疫组化染色

4.CTA：术后6周缝线吻合组(图9B)与无缝线组(图9A)的CTA，表明缝线组与无缝线组都能成功实现断端血管的通畅(P>0.05)。术后6周的CTA可以看出，实验组及缝合组吻合口远端均有造影剂通过，表明两种方法都能成功实现断端血管的通畅，但是缝合组中可以看到吻合口周围有明显的狭窄，而实验组并没观察到明显的狭窄存在，表明新缝合法能够在一定程度上降低血管远期狭窄的可能性。

图9 术后6周的CTA

5.血管彩色多普勒：术后6周缝线吻合组(B)与无缝线组(A)的多普勒超声结果比较，表明无缝线组与缝线组在血管直径及血流量差异无统计学意义(P>0.05,图10)。术后6周的血管彩色多普勒检测结果可以看出实验组与缝合组的血管直径及血流量比较差异无统计学意义(P<0.05)

图10 术后6周多普勒超声结果

6.吻合口愈合情况：术后1年缝线吻合组与无缝线组的扫描电镜结果比较，无缝线组比缝线组引起了较少的内皮损伤(图11)。可以看出两种方法均恢复了血管内皮的连续性，完成了断端血管的愈合，但实验组中吻合口较平整光滑且未形成明显的缩窄环。

讨 论

目前应用的各种血管吻合方法基本分为两类，针线缝合法和无缝线吻合法。中小血管的针线缝合法常需要在显微镜下操作，对术者的操作技能要求极高。即使有熟练的操作技术，仍有不可避免的缺陷：缝合过程中常需夹闭两断端，这将使远端断肢处于暂时缺血状态，缝合时间过长将加重受损肢体的进一步缺血性损伤；吻合口张力通常较大，缝线过紧将导致血管壁缝线拖拉损伤，而且缝线过松则漏血，血管吻合口的狭窄和血管痉挛是血管远期和近期通畅率不佳的主要原因，对血管壁的全层针刺损伤及作为异物存留的缝线常导致吻合口周围炎性细胞增生及异物肉芽肿形成，这将引起吻合口的狭窄，导致断端血管的远期通畅率不理想。在过去40 多年中，直径>6mm的大血管的缝线吻合操作比较成熟，术后 5 年通畅率超过95%，而直径≤6mm的中小血管吻合术多在5 年内发生吻合口狭窄[6]。吻合口狭窄的主要原因是血管壁对其损伤的反应性重构及内膜增生[7]。为防止血管吻合后再狭窄，应该避免或减轻各种原因所致的血管壁损伤，术中提倡“无接触技术”(no touch technique)，最大限度地减少手及器械与血管壁的接触。但血管显露、血管横断以及传统血管吻合等对血管壁的缝针穿刺和缝线拖拉是不可避免的，所以从血管吻合的方式上寻找突破口是重要研究方向。因此研究者试图寻求更理想的无线血管吻合方法，这些吻合方法可总括为：套入吻合法、热凝吻合法、黏合吻合法及机械吻合法[8～11]。

血管机械吻合法是目前国内外研究最多的无线吻合方法，由于其避免了吻合口处内膜的损伤，因此可最大程度地避免吻合口的狭窄。按吻合原理，现代机械性血管吻合方法分为5大类型：① 磁管法；②订书针法；③ 套管法；④吻合夹法；⑤针环法等[12～16]。①、②因缺点较多已基本弃用；③套管法的其原理是一侧血管穿过套管，边缘外翻180o包住套管，插入另一侧血管腔内，并环形结扎固定而完成吻合。采用钻有数个小孔的套管，血管行套管吻合后，用小针穿过血管壁插入小孔中，以防止血管滑动，即内锁套管法。尽管1984年Daniel等[17,18]创用套管耦合器将此法进行了改进，但有几个缺陷是无法克服的：靠套入后的结扎生物力学不安全，稍微有张力吻合口有滑开的可能，如果用内锁套管法又损伤了血管内膜。外翻180°增加了操作难度，对僵硬的血管更是如此。需耗费一段血管；④吻合夹法：血管吻合夹吻合法(VCS)是由Kirsch等[19]于1992年首先创用的，其吻合原理为，先以外翻钳将两断端血管壁外翻对齐，吻合夹由“C”形变为近似“O”形夹合血管壁。尽管近几年国内外有研究对此进行了基础研究和临床尝试，但这种方法操作并不简便，因为单就断端血管壁外翻对齐这一操作没有器械辅助非常不方便，而辅助器械的结构又很复杂，不易加工制作；另外一个显而易见的缺点就是血管吻合夹夹合程度很难确定，夹合轻，吻合口有脱开的危险，夹合重，管腔狭窄。因此限制了临床使用；⑤针环法：研究较深入，发展较快，应用亦较多。其主要装置是两个各带有均匀相间6根小针及6个小孔的聚四氟乙烯小环，吻合时分别将两血管断端穿过两个小环并外翻90°固定于6根小针上，两环针孔相嵌对而完成吻合。1962年，Nakayama等[20]将针环材料改为金属，特制2把持环钳用来夹持针环，简化了对合过程，并将嵌合后的小针压弯，使两针环牢固。此器械吻合简单迅速，通畅率高，可由单人操作。但是，坚硬的聚乙烯环永久地留在吻合口，限制血管收缩、扩张等调节功能和血管的生长，不能用于未成年患者[21]。残留的不锈钢针可引起异物反应，在血管外膜形成肉芽肿。

本研究中无缝线吻合用到的可吸收记忆套管材料主要成分为为聚己内酯，为美国FDA批准临床使用材料，添加的辅料偶联剂为烃氧基硅烷[5]。多官能团单体选自含2～3个烯键的有机酯，如季戊四醇三烯酸酯等；填料选自含有活性钙离子的化合物，如磷酸氢钙等，均为生物相容性良好，且可吸收的材料。研究证实其具有良好的生物相容性，对细胞增殖无不利作用，在体内也没有引起炎性反应、过敏及其他不良反应[22]。利用可吸收形状记忆套管作为断端桥接载体，由于该材料在术后3个月左右才可完全生物降解，术中及术后一段时间可对血管吻合口起临时性支撑作用。利用套管的支撑作用，术中可使两断裂口紧密对合，有利于组织胶水涂抹均匀，从而使吻合口粘合牢固。断裂口粘合完毕后，在断裂口外部再套一形状记忆套管可对吻合口起临时性保护作用。该无缝线吻合法操作流程较针线缝合简单，在实验中完成血管吻合的平均时间为13min，这将大大降低组织的缺血性损伤时间, 操作过程中完全没有对血管壁的穿刺性损伤，能避免血管壁对损伤的反应性重构及内膜增生(vascular intimal hyperplasia, VIH)，不会引起血管吻合口炎性细胞大量增生，也不会有缝线所引起的异物肉芽肿，从而能有效的防止血管吻合口的狭窄，也不存在血管吻合后的血管痉挛引起的组织缺血，因而能提高血管近期及远期通畅率，提高血管吻合术成功率。

笔者利用可吸收形状记忆套管建立了一种新的无缝线微小血管吻合方法。该吻合方法与传统针线缝合比较具有以下优势：吻合操作简单，吻合所需时间少，能明显减少血管血流阻断时间，防止血流阻断时间过长而引起相应的并发症。操作过程中完全没有对血管壁的穿刺性损伤，吻合口术后炎性反应较轻，血管吻合口内皮无异物肉芽肿组织，能减少血管吻合口狭窄的发生率，保证血管的通畅率。由于操作简单易掌握，将极大地促进血管吻合手术的普及，为更多的患者解除痛苦，因此该吻合系统具有极强的临床可行性和深远的社会效益。