目前，心血管疾病是全球人类头号死因，占死因构成的46%，且呈年轻化和持续增长的趋势[1- 2]。糖尿病发病率升高是造成心血管疾病发病率居高不下的一个重要原因。既往研究表明，糖尿病患者并发冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)的风险是非糖尿病患者的4倍[3]。糖尿病患者血糖水平升高，其体内糖基化终末产物(AGEs)水平也明显上升；AGEs可与糖基化终末产物受体(RAGE)结合，通过下游信号引起氧化应激和内皮功能紊乱，参与动脉粥样硬化的形成与发展[4]。本课题组前期研究发现，糖尿病合并动脉粥样硬化患者的外周血中卵泡抑素样蛋白1(FSTL1)显著升高[5]。本研究旨在探讨AGEs和FSTL1参与调控糖尿病动脉粥样硬化发生和发展的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

通过临床采血收集糖尿病合并动脉粥样硬化患者血清；野生型C57BL/6小鼠(雄性，6周龄)购自南京大学模式动物研究中心[动物生产许可证号为SCXK(苏)2015-0001，动物使用许可证号为SYXK(沪)2013-0050]，同种系RAGE基因敲除(RAGE-/-)小鼠由美国哥伦比亚大学赠送；检测FSTL1和AGEs水平的ELISA试剂盒分别购自英国Abcam公司和中国武汉华美生物工程有限公司；小鼠巨噬细胞系RAW264.7购自中国科学院细胞库；RPMI 1640培养液及双抗购自美国Gibco公司；胎牛血清购自美国HyClone公司；AGEs-BSA购自德国Merck公司；兔抗人FSTL1单克隆抗体购自英国Abcam公司，兔抗人RAGE、AP-1、c-Jun和β-actin单克隆抗体及辣根过氧化物酶耦联的羊抗兔二抗均购自美国Cell Signaling公司；正常小鼠IgG单克隆抗体购自美国eBioscience公司。

1.2 患者血清样本收集

入组标准：经上海交通大学医学院附属瑞金医院医学伦理委员会批准，收集糖尿病合并动脉粥样硬化患者外周血。所有患者均签署知情同意书。动脉粥样硬化患者行冠状动脉造影(CAG)和血管内超声(IVUS)检查确诊，糖尿病患者行口服葡萄糖耐量试验(OGTT)确诊。共收集糖尿病合并动脉粥样硬化患者血清104份，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测患者血清中FSTL1及AGEs水平。

排除标准：(1)有急性感染史；(2)有风湿性疾病史；(3)女性有近期月经史；(4)严重肝肾功能异常者。

1.3 小鼠腹腔巨噬细胞的分离、培养及鉴定

对野生型和同种系RAGE-/-小鼠腹腔注射0.9%氯化钠溶液5 mL；静置5～7 min后，用注射器抽取腹腔液；1 500 r/min离心10 min，弃上清液，PBS洗涤2次。用含10%胎牛血清和1%双抗的RPMI 1640培养液调节细胞密度至2×106个/mL，接种于培养瓶及6孔板，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养12 h，然后用倒置显微镜观察细胞形态[6]。

将细胞悬液与0.4%锥虫蓝溶液按体积比为9∶1混合，混匀后在3 min内分别计数活细胞和死细胞。光学显微镜下观察细胞形态，死细胞被染为明显的蓝色，而活细胞呈无色透明状。

1.4 RAGE抗体预处理

将小鼠RAW264.7巨噬细胞以2×106个/孔的密度接种至6孔板，用含10%胎牛血清和1%双抗的RPMI 1640培养液，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。加入RAGE抗体(10 μg /mL)及正常小鼠IgG抗体(10 μg/mL，作为阴性对照)预处理1 h，然后加入不同质量浓度(0、50、100、200 μg/mL)的AGEs-BSA刺激24 h和48 h。

1.5 ELISA法检测FSTL1及AGEs水平

将血液标本及不同浓度标准品分别加入96孔板中，于37 ℃孵育90 min。弃孔内液体后，倒扣96孔板并拍干孔内液体，加入生物素化抗体，用封板胶纸封住反应孔，于37 ℃孵育60 min。洗板拍干，加入亲和素-生物素-辣根过氧化物酶复合物工作液，封孔，于37 ℃孵育30 min。洗板后拍干，加入显色剂3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(90 μL/孔)，封孔，避光。于37 ℃孵育20 min。加入终止液100 μL/孔，混匀后即刻测量450 nm处吸光度。

1.6 Western blot法检测相关蛋白表达

用RIPA裂解液提取不同条件培养后的小鼠RAW264.7巨噬细胞和小鼠腹腔原代巨噬细胞中的总蛋白，同时收集细胞培养液上清液。取20 μg总蛋白，经缓冲液处理后加热变性，以10%聚丙烯酰胺凝胶电泳(100 V稳压)分离蛋白；然后采用电转移法，将蛋白条带转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，室温封闭1 h；漂洗后分别加入兔抗人FSTL1、RAGE、AP-1、c-Jun和β-actin单克隆抗体，4 ℃孵育过夜；Tris-HCl缓冲液(TBST)漂洗后，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1 h；TBST漂洗后，成像仪曝光并分析目的蛋白条带的相对灰度值。

1.7 统计学分析

应用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析。各计量资料进行正态性检验，非正态分布数据采用对数转换后符合正态分布，计量资料采用均数±标准差表示。两组间比较采用独立样本t检验。两组连续性变量比较采用Pearson相关性分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 糖尿病合并动脉粥样硬化患者外周血FSTL1与AGEs水平呈正相关

运用ELISA法分别检测104例糖尿病合并动脉粥样硬化患者外周血中FSTL1及AGEs水平，并对两者进行相关性分析。结果发现，在糖尿病合并动脉粥样硬化患者中，血清AGEs水平与FSTL1水平呈正相关(r=0.148，P=0.021)，见图1。

图1 糖尿病合并动脉粥样硬化患者外周血中AGEs与FSTL1水平的相关性分析

2.2 AGEs通过AGEs-RAGE信号通路促进巨噬细胞中FSTL1的表达和分泌

为验证AGEs与FSTL1表达及分泌量之间的关系，用不同质量浓度的AGEs-BSA(0、50、100、200 μg/mL)刺激小鼠RAW264.7细胞24 h。Western blot法检测结果显示，巨噬细胞中FSTL1的表达及分泌量明显增加，且在AGEs-BSA质量浓度为200 μg/mL时FSTL1表达及分泌量最高(P均<0.05)，见图2A。

为明确AGEs是否通过AGEs-RAGE信号通路调控FSTL1的表达及分泌，进一步运用RAGE特异性抗体阻断RAW 264.7细胞中AGEs-RAGE信号通路。Western blot检测结果显示，与阴性对照组相比，RAGE特异性抗体显著抑制AGEs-BSA诱导的FSTL1表达及分泌(P均<0.05)，见图2B。

注：A为不同浓度的AGEs-BSA刺激巨噬细胞24 h后，Western blot法检测FSTL1的表达及分泌量；B为使用RAGE抗体(10 μg/mL )拮抗AGEs-RAGE信号通路，并且使用AGEs-BSA(200 μg/mL)刺激巨噬细胞24 h后，Western blot法检测FSTL1的表达及分泌量

2.3 AGEs通过AGEs-RAGE信号通路促进巨噬细胞中核转录因子AP-1和c-Jun的表达

用不同质量浓度的AGEs-BSA(0、50、100、200 μg/mL)分别刺激RAW264.7细胞24 h及48 h，运用Western blot法检测AP-1和c-Jun的表达情况。结果发现，AGEs-BSA刺激细胞24 h和48 h后，细胞AP-1和c-Jun的表达水平明显升高(P均<0.05)，见图3A。分离培养野生型及RAGE-/-小鼠原代巨噬细胞，并分别予以AGEs-BSA(200 μg/mL)刺激，Western blot法检测发现，RAGE-/-组AP-1和c-Jun的表达水平明显下降(P均<0.05)，见图3B、C。同样，用AGEs-BSA(200 μg/mL)刺激RAW264.7细胞，并运用RAGE特异性抗体阻断AGEs-RAGE信号通路，Western blot法检测结果显示，RAGE特异性抗体显著抑制AP-1和c-Jun的表达(P均<0.05)，见图3D。

注：A为不同质量浓度AGEs-BSA刺激RAW 264.7细胞后，Western blot法检测AP-1及c-Jun的表达；B为RAGE-/-小鼠的表型鉴定；C为200 μg/mL AGEs-BSA分别刺激野生型小鼠及RAGE-/-小鼠来源的原代巨噬细胞后，Western blot法检测AP-1及c-Jun的表达；D为200 μg/mL AGEs-BSA刺激RAW264.7细胞后，用RAGE特异性抗体阻断AGEs-RAGE信号通路，Western blot法检测AP-1及c-Jun的表达

3 讨论

糖尿病是一种普遍存在且严重损害人类健康的疾病，它不单纯是一种糖类物质代谢障碍性疾病，目前被认为是冠心病的等危症。糖尿病患者因心肌梗死导致死亡的风险是非糖尿病患者的2～3倍[7]。糖尿病患者体内持续的高血糖环境可以促进糖代谢产物与蛋白质、脂质或核酸的还原性氨基发生非酶促糖基化反应，最终形成AGEs。AGEs可与特异性受体RAGE、半乳糖凝集素-3(Gal-3)及巨噬细胞清道夫受体等结合而发挥作用[8]。已有研究证实，在糖尿病合并动脉粥样硬化患者的斑块组织中RAGE呈高表达，且由其介导的损伤在糖尿病心血管系统损伤中占主导地位[9]。

FSTL1是一种由间充质细胞产生的糖化分泌蛋白，属于富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(SPARC)家族[10]。FSTL1参与多种疾病的发生与发展，可能与炎性反应、血管新生、细胞增殖和凋亡、肿瘤细胞迁移和侵袭、突触传递有关[11-13]。本课题组前期研究发现，FSTL1高表达于糖尿病动脉粥样硬化斑块的巨噬细胞中，而且FSTL1可显著促进巨噬细胞中白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和β-干扰素(IFN-β)等炎性因子的表达[5]。

本研究发现，糖尿病动脉粥样硬化患者外周血AGEs水平与FSTL1水平呈正相关。因此，推测FSTL1高表达于糖尿病动脉粥样硬化斑块的巨噬细胞，可能与外周血中高浓度的AGEs有关。另外本研究还发现，用AGEs刺激巨噬细胞后，FSTL1表达及分泌量均上升。既往研究表明，糖尿病合并动脉粥样硬化患者的斑块组织中RAGE呈高表达。因此，本研究进一步运用RAGE特异性抗体阻断AGEs-RAGE信号通路，观察FSTL1的表达情况，发现RAGE抗体封闭其受体活性后，FSTL1的表达及分泌量均被明显抑制，提示AGEs-RAGE信号通路可能参与调控糖尿病动脉粥样硬化中FSTL1的表达。

AGEs-RAGE信号通路主要通过激活核因子κb(NF-κb)及AP-1，促进炎性因子的表达[14-15]。为进一步明确RAGE信号通路对FSTL1表达的调控作用，本研究根据前期对FSTL1基因结构的分析结果，推测FSTL1基因5′启动子区受转录因子AP-1和c-Jun的调节。本研究进一步用AGEs-BSA刺激巨噬细胞，发现AP-1及c-Jun表达水平升高；分别采用RAGE特异性抗体及构建RAGE-/-小鼠以阻断AGEs-RAGE信号通路，结果发现巨噬细胞中AP-1和c-Jun的表达水平均明显降低。

综上所述，本研究发现AGEs-RAGE信号通路通过调控巨噬细胞中转录因子AP-1及c-Jun的表达来调节FSTL1活性，而且FSTL1是一个潜在的影响糖尿病动脉粥样硬化发生与发展的调控因子。本研究揭示了AGEs和FSTL1在糖尿病动脉粥样硬化发病中的作用机制，这为寻找糖尿病动脉粥样硬化药物防治的新靶点提供了线索。但对于AGEs调控FSTL1表达的具体分子机制，还有待于更深入的研究。