吴同垒，王洪彬，张志强，高桂生，史秋梅

（河北科技师范学院河北省预防兽医学重点实验室，河北 秦皇岛 066604）

中国水产养殖量占世界总量的65%，为世界水产养殖业做出了重大贡献[1]。2005—2015年，中国的海水养殖面积年均增长率为3.61%，养殖总产量年均增长率为3.25%[2]。随着海水养殖业迅速发展，规模化、集约化程度加深，海水养殖的病害也逐年增加。其中由致病性弧菌引起的弧菌病一直是海水鱼类及贝类养殖的“灾祸之源”[3,4]。近年来，相继有大黄鱼 Larimichthyscrocea、斜带石斑鱼Epinepheluscoioides、青石斑鱼Epinephelus awoara等养殖鱼类及文蛤Meretrix meretrix L.、杂色鲍Haliotis diversicolor、方斑东风螺Babylonia areolata等养殖软体经济动物感染哈维氏弧菌Vibrio harveyi发病死亡，给世界水产养殖业，尤其是亚洲、南美洲水产养殖业造成巨大的经济损失，引起了养殖工作者的重视[5]。

近年来，水产养殖病原菌的耐药现象极为普遍，给防控细菌性疾病带来了极大的挑战。疫苗能提高动物机体特异性免疫水平，且符合绿色、健康的养殖要求[6]，因此，研制新型疫苗是防控水产养殖细菌性疾病的重要方向。生物被膜指细菌在代谢过程中黏附在非生物或生物基质的表面，由自身产生的胞外聚合物及基质包裹，具有三维结构的细胞群体，利于细菌抵抗外界不利因素[7]，具有分布广及多重耐药性、免疫逃避能力等特点。Karunasagar等[8]报道，哈维氏弧菌能在不同非生物基质表面上形成生物被膜；Yatip等[9]研究了发酵豆制品纳豆提取物对哈维氏弧菌生物被膜的抑制作用，而有关哈维氏弧菌生物被膜的其他方面研究较少。本试验以致病性哈维氏弧菌QHD-1菌株为研究对象，测定初始菌液浓度、温度、pH、盐离子浓度等环境因素对QHD-1菌株生物被膜形成能力的影响，以了解不同理化条件下哈维氏弧菌生物被膜形成规律，为探索其致病机理及防治措施奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

哈维氏弧菌V.harveyi QHD-1分离菌株由从患病大菱鲆肝脏中分离得到，经分离纯化、鉴定及动物致病性试验，证实其为致病性菌株。现保存于本实验室-80℃超低温冰箱中。

主要试剂与仪器：胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）和胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）购自北京索莱宝生物科技有限公司；结晶紫购自天津市永大化学试剂有限公司；考马斯亮蓝G-250购自天津市百世化工有限公司；96孔聚苯乙烯板购自国药集团化学有限公司；酶标仪购自Microplate Autoreader EL311；超低温冰箱购自澳柯玛股份有限责任公司；其他与本试验相关的试剂与仪器均由本实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 菌株活化及菌悬液的配制

从-80℃超低温冰箱中，取出哈维氏弧菌QHD-1甘油冻存菌株，于TSA培养基上划线，30℃培养；挑取单菌落接种于质量分数为2%NaCl的TSB 培养液中，30℃培养 10h，6 000r/min 离心15min，收集菌体，用无菌生理盐水清洗3次，收集细菌细胞，最后用无菌生理盐水稀释至终浓度为1×108cfu/mL。

1.2.2 理化因子对QHD-1生长的影响

生长曲线的测定：在50mL TSB培养液中加入适量体积对数期的哈维氏弧菌QHD-1菌液，于30℃、220r/min摇床中培养。每隔1h取样一次，以OD590为纵坐标，时间为横坐标绘制生长曲线。

盐离子浓度：分别配制0%～8%NaCl的TSB培养液，加入适量对数期哈维氏弧菌QHD-1菌液，于30℃、220r/min摇床中培养12 h后，取样，测定菌液OD590。以OD590为纵坐标，盐离子为横坐标绘图。比较盐离子浓度对哈维氏弧菌QHD-1生长的影响。

温度：将培养温度分别设为4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃，方法同 1.2.2，比较温度对QHD-1生长的影响。

pH：用NaOH和HCl调节TSB培养基pH，分别为1～10（间隔1个单位），方法同1.2.2。比较pH对哈维氏弧菌QHD-1生长的影响。

NH4+浓度：分别在培养基中添加（NH4）2SO4，使含量分别为0%～2.0%，方法同1.2.2。比较NH4+对QHD-1生长的影响。

Mg2+浓度：分别在培养基中添加MgSO4，使其含量分别0%～8%，方法同1.2.2。比较Mg2+对QHD-1生长的影响。

1.2.3 生物被膜的形成与测定

哈维氏弧菌生物被膜的形成与定量测定参考文献[10]中报道的方法进行，并略加改动。在96孔聚苯乙烯板每孔中加入TSB培养液150μL，加入菌液（浓度1×108cfu/mL）50 μL；将96孔聚苯乙烯板置于湿盒中，30℃中孵育16h；每组做5个平行孔，以TSB培养基为空白对照；吸出孔内菌液，生理盐水冲洗3次，去除游离细菌；将聚苯乙烯孔板干燥固定30min。每孔加入质量分数为0.1%的结晶紫200μL，常温下放置10min后吸出染液；用生理盐水洗板孔3次，干燥；于每孔中加入体积分数为33%的乙酸200μL，溶解结晶紫，利用酶标仪测定OD590。

1.2.4 初始菌液浓度对哈维氏弧菌V.harveyi QHD-1生物膜形成的影响

将QHD-1浓度调至1.0×109cfu/mL，依次倍比稀释，得到菌悬液浓度为1.0×108～1.0×102cfu/mL，培养方法同1.2.2。

将孵育温度设定为 4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃，pH 为 2～10，NaCl浓度为0%～9%，培养方法同1.2.2。

1.3 数据处理

结果以平均数和标准偏差表示（x±s），用excel、SPSS19.0软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 分离菌株QHD-1生长曲线

由图1可知，在30℃时，该菌很快进入快速生长阶段，从第1h到8h为对数生长期，而后在一段时间内维持在较高水平，即稳定期，从第9h后进入衰退期。

图1 V.harveyi QHD-1生长曲线Fig.1 Growth curve of V.harveyi QHD-1

2.2 不同理化因子对QHD-1生长的影响

2.2.1 盐离子浓度对QHD-1生长的影响

由图2可知，盐离子浓度为0%～6%时，菌株的生长速度不同：盐离子浓度在1%～7%之间时，培养12h后培养液达到较高的浓度，尤以3%盐离子浓度时，QHD-1生长最快；盐离子浓度在7%～8%之间时，QHD-1浓度较低，而盐离子浓度为8%时，菌株QHD-1只有少量生长。这说明盐离子浓度不同对菌株QHD-1生长的影响不同。

图2 盐离子浓度对V.harveyi QHD-1生长的影响Fig.2 Effect of salt ion concentration on the growth of V.harveyi QHD-1

2.2.2 温度对QHD-1生长的影响

由图3可知，哈维氏弧菌QHD-1在15～35℃范围内，生长良好；在25℃、30℃和35℃中培养12h后，菌液浓度较高，但差异不显著；温度为10℃培养12h，菌株QHD-1生长较缓，在4℃下培养12h，菌株QHD-1不生长。这说明温度影响哈维氏弧菌菌株QHD-1的生长。

图3 温度对V.harveyi QHD-1生长的影响Fig.3 Effect of temperature on the growth of V.harveyi QHD-1

2.2.3 pH对QHD-1生长的影响

由图4可知，不同pH对哈维氏弧菌QHD-1的生长影响差异较明显。当pH在6～9之间时，菌株生长良好；在pH＜4或pH＞10时，菌株生长较缓，甚至不生长。

图4 pH对V.harveyi QHD-1生长的影响Fig.4 Effect of pH value on the growth of V.harveyi QHD-1

2.2.4 NH4+对QHD-1生长的影响

结果显示，不同NH4+含量对QHD-1生长的影响不同。当 TSB培养基中添加（NH4）2SO4时，NH4+促进了菌株QHD-1的生长；当（NH4）2SO4含量为0.05%时，促生长作用最佳。这说明NH4+能促进哈维氏弧菌QHD-1的生长。

2.2.5 Mg2+对QHD-1生长的影响

结果显示，不同Mg2+含量对菌株QHD-1生长的影响不同。当Mg2+含量在0%～8%之间时，均能促进菌株QHD-1的生长，尤其是Mg2+含量为1%时，对菌株QHD-1促生长作用最明显。这说明Mg2+能促进哈维氏弧菌QHD-1的生长。

2.3 培养条件对哈维氏弧菌V.harveyi QHD-1生物被膜的影响

2.3.1 初始菌液浓度对哈维氏弧菌V.harveyi QHD-1生物膜形成的影响

由图5可知，菌液浓度为1.0×102～1.0×109cfu/mL时，生物被膜形成量逐渐升高；当菌液浓度＜1.0×107cfu/mL时，生物被膜形成量少；初始菌液浓度低于该浓度时，生物被膜的形成量之间无显著差异；当初始菌浓度达到1.0×108cfu/mL～1.0×109cfu/mL时，细菌生物被膜成膜量显著增加，与其他初始菌浓度下的生物被膜形成量差异极显著（P＜0.01）。这说明初始菌液浓度影响菌株生物被膜的形成。

2.3.2 不同温度对哈维氏弧菌成膜的影响

由图6可知，当培养温度在4～20℃之间时，菌株QHD-1生物被膜形成量较低；当培养温度在25～35℃之间时，菌株生物被膜形成量较高，且维持较高水平；30℃时，菌株QHD-1生物被膜形成量达峰值，与其他温度下菌株生物被膜形成量差异极显著（P＜0.01）；当温度为40℃时，生物被膜形成量较低。

图5 初始菌液浓度对哈维氏弧菌V.harveyi QHD-1生物膜形成的影响Fig.5 Effect of initial bacterial concentration on the biofilm formation of V.harveyi QHD-1

图6 培养温度对哈维氏弧菌成膜形成的影响Fig.6 Effect of incubation temperature on the film formation of V.harveyi QHD-1

2.3.3 pH对哈维氏弧菌V.harveyi QHD-1生物膜形成的影响

由图7可知，当pH为7～8时，菌株QHD-1生物被膜形成量最大，与其他组差异显著（P＜0.05）；当pH＜4时，菌株QHD-1生物被膜的形成量较低；而当pH升高到5～9时，则逐渐升高，pH为8时，形成量最大。这说明pH影响菌株QHD-1生物被膜的形成。

图7 pH对V.harveyi QHD-1生物膜形成的影响Fig.7 Effect of pH value on the biofilm formation of V.harveyi QHD-1

2.3.4 盐离子浓度对哈维氏弧菌V.harveyi QHD-1生物膜形成的影响

由图8可知，当NaCl含量在1%～5%时，该菌生物被膜形成量逐渐增加，且NaCl浓度在5%时，生物被膜形成量最大，与其他NaCl含量生物被膜的形成量差异极显著（P＜0.01）；当NaCl含量＞5%时，菌株QHD-1生物被膜形成量下降；NaCl含量在0%和8%时，菌株QHD-1几乎不形成生物被膜。

图8 盐离子浓度对V.harveyi QHD-1生物膜形成的影响Fig.8 Effect of salt ion concentration on the formation of V.harveyi QHD-1 biofilm

3 讨论

引起鱼类疾病的原因有很多，主要包括环境、传染性病原等，如病毒、寄生虫、细菌等[11]。一些致病性弧菌引起的细菌病在水产养殖中频发，给海水养殖业造成巨大经济损失。

生物被膜形成能力是细菌致病性和耐药性强弱的重要影响因素。生物被膜的形成是个动态过程，不同阶段生化特性不同，且受多种因素的影响[12,13]。本试验结果显示，哈维氏弧菌V.harveyi QHD-1能形成生物被膜，且受多种因素的影响，其中与起始菌液浓度关系最密切。当菌液浓度在1.0×102～1.0×107cfu/mL时，对该菌生物被膜的形成量影响不大，原因可能与游离菌密度较低时，细菌初期黏附在聚苯乙烯板上的细菌量少有关；当菌液浓度为1.0×108～1.0×109cfu/mL时，生物被膜形成量较大，与李海平等[14]研究结果一致。陈强等[15]的研究结果也表明细菌的粘附量与菌液浓度关系密切，且呈正比关系。因此，可认为细菌黏附促进了其生物被膜的形成，而细菌的黏附量会随着菌液浓度的升高而增加。细菌起始浓度高有利于生物被膜的形成，温度也影响细菌生物被膜的形成。本研究中，在 4℃、10℃、40℃时，菌株 V.harveyi QHD-1 生物被膜形成量较少，25～35℃之间是形成生物被膜的最适温度，与菌株V.harveyi QHD-1的最适生长温度接近，这表明哈维氏弧菌在活力最好时形成生物被膜最强。本试验结果显示，pH为2～10时，哈维氏弧菌V.harveyi QHD-1菌株均能形成生物膜，而pH8时，形成的生物膜量最大，这与李海平等[14]研究结果一致。渗透压显著影响生物被膜的形成。本实验结果显示，哈维氏弧菌V.harveyi QHD-1在NaCl质量分数为2%～8%时，均可形成生物被膜；当NaCl含量在0时，几乎不能形成生物被膜，这与李海平等[14]研究结果一致。鄢庆枇等[16]、尹清干等[13]研究发现，NaCl浓度为0时，细菌形成生物被膜的效果很差，可能与细菌在介质上粘附量有关。黏附是细菌成膜的第一步，无法黏附在基质上就难以形成生物被膜；当NaCl浓度过高时，抑制细菌形成生物被膜的原因可能是细菌受到环境生存压力较大，影响了细菌的生长。

综上所述，哈维氏弧菌V.harveyi QHD-1形成生物膜与外界环境因子变化关系密切，而初始菌液浓度、温度、pH、盐度等各种环境因子均能显著影响哈维氏弧菌V.harveyi QHD-1生物被膜的形成。