王日明，王志强，向佐湘

（1. 北部湾大学资源与环境学院，广西 钦州 535011；2. 湖南芷兰生态环境建设有限公司, 湖南 长沙 410000；3. 湖南农业大学农学院草业科学系, 湖南 长沙 410128）

草坪在现代城市发展和日常生活中起着越来越重要的作用。南方亚热带过渡区6-8月份气温常达35～38 ℃, 而对于大多数的冷季型草坪草来说，在夏季高温条件下普遍难以越夏。多年生黑麦草(Lolium perenne)是城市和庭园绿化以及足球场运动草坪建植中常用的冷季型草种，因其具有草坪质量优异、分蘖性能好、成坪迅速等优点，常被作为草坪建植的先锋草种。黑麦草的最适生长温度范围为15～25 ℃，高于35 ℃时植株的生长发育不良，草坪质量下降甚至植株死亡[1-2]。

温度过高通常会伤害植物的细胞膜，进而影响植物的正常生长发育。高温胁迫下植物体内会产生大量的超氧阴离子 (superoxide anion, O2·¯)、单线态氧 (singlet oxygen,1O2) 以及过氧化氢 (hydrogen peroxide, H2O2)等 活 性 氧 (reactive oxygen species,ROS)[3]。但由于植物体内同时具有相应的ROS清除系统，使得ROS的产生和消除处于动态平衡状态。当ROS含量到达一定程度或出现过剩时，破坏细胞内的大分子结构，造成细胞膜出现膜脂过氧化，导致植物代谢失调、光合降低等变化。在植物的细胞体内存在由酶促抗氧化和非酶促抗氧化反应组成的两套ROS清除系统，酶促抗氧化主要 有 超 氧 化 物 歧 化 酶 (superoxide dismutase, SOD)、过氧化氢酶(catalase, CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase, APX)及过氧化物酶 (Peroxidase,POD)等，高温胁迫常诱导这些抗氧化酶大量合成和活性提高[4]。因此，SOD、POD、CAT和APX等抗氧化酶活性的高低常作为植物耐高温能力的判定指标之一。

γ-氨基丁酸(GABA)是在动植物体内普遍存在的四碳非蛋白类氨基酸。GABA可以作为外源小分子物质参与到植物的生长发育和逆境胁迫调控等一系列的生理代谢途径[5]。当植物受到水分、温度、盐碱等一些逆境胁迫时，植物体内GABA的含量大量增加而抗逆性提高[6]。外源GABA可作为临时氮库，通过清除活性氧自由基[7-8]、调节pH和渗透调节等作用减缓逆境胁迫对植株的伤害[9]。外源GABA能够增强番茄(Lycopersicon esculentum)[10-11]、网纹甜瓜(Cucumis melo)[7]、黄瓜(Cucumis sativus)[12-13]、小麦 (Triticum aestivum)[14]、玉米 (Zea mays)[15]、白三叶(Trifolium repens)[16]、等植物在干旱、盐害、冷害、缺氧、淹水等逆境胁迫中的抗性。但是关于外源GABA能否提高多年生黑麦草的耐热性，尤其是在高温胁迫下外源GABA对黑麦草的抗氧化防御系统及内源激素代谢的影响未见报道。因此，本研究在前期试验的基础上，以耐热性弱的黑麦草品种为材料，研究外源GABA对高温胁迫下黑麦草的生长和草坪质量、叶绿素含量、根系活力、ROS代谢、抗氧化酶的活性及其基因的表达和内源激素代谢的影响，探讨外源GABA影响多年生黑麦草抗热性的生理机制，为进一步研究外源GABA增强植物抗逆能力奠定基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料

本研究以耐热性弱的多年生黑麦草品种‘顶峰'(Pinnacle)为试验材料[17]。

1.2 试验设计与处理

将黑麦草种子播种于塑料花盆中，花盆的尺寸为上口径 15 cm、下口径 10 cm、高 15 cm，栽培基质为体积比1∶1混合均匀的市售花卉培养基质和河砂，放置于湖南农业大学教学科研试验温室中培养。待发芽后苗高约8 cm时开始修剪，修剪高度保持在6 cm左右，每周每盆浇Hoagland's营养液 200 mL。

播种好的花盆放置于温室中培养约45 d，然后将各盆栽材料转入生长箱内预培养3 d，培养条件为温度 25 ℃/20 ℃(昼/夜)，相对湿度 65%～75%，光周期 12 h，光合有效辐射 400 μmol·(m2·s)-1。盆栽材料在生长箱预培养3 d后开始进行试验处理，每盆喷施GABA溶液100 mL并同时浇灌150 mL 0、2.5、5、10 和 20 mmol·L-1的 GABA 溶液，上述步骤2 d后开始进行温度处理，一个生长箱昼夜温度设为25 ℃/20 ℃(常温)，另一个生长箱昼夜温度设为 35 ℃/30 ℃(高温)；共处理 7 d，待筛选出最佳GABA浓度后重复上述试验步骤进行相关指标的测定，试验共设4个处理(对照、常温+GABA、高温、高温+GABA)，每个处理设4次重复(4盆)，完全随机试验设计。各处理盆栽材料每天浇水保持土壤体积含水量为30%～32%，防止干旱。在高温处理后的7、14和21 d取样进行测定分析。每盆取倒数第3～5片功能叶片剪成约1 cm长的小段后混匀，在液氮速冻后保存于-80 ℃冰箱备用。

1.3 测定项目与方法

1)生长速率：试验处理前将冠层修剪整齐并测定高度，然后在处理的7、14和21 d用直尺测定各处理的冠层高度，两者之差再除以处理天数为生长速率，单位为cm·d-1。

2)草坪质量：采用目测法，根据草坪的色泽、密度、质量和均一性进打分评价(0～9分)。

3)电导率：取约0.1 g叶片，用去离子水冲洗干净，剪成1 cm的小段置于试管中，加去离子水10 mL后在室温条件下，转速 200 r·min-1，振荡 24 h 后，测外渗液的电导率(E1)，然后封口在高压灭菌锅中高温高压灭菌15 min，冷却至室温后测电导率(E2)，再按下式计算：相对电导率 = [E1/E2] × 100%。

4)叶绿素含量：样品经二甲基亚砜浸提后，采用分光光度计法测定[18]。

5)根系活力测定：根据TTC还原法进行测定[19]。

6)活性氧和抗氧化酶活性测定：采用pH 7.8的磷 酸 缓 冲 液 (phosphate buffer solution, PBS)提 取 酶液。根据Hu等[20]的方法，用硫酸钛法测定H2O2含量，羟胺氧化反应法测定O2·¯产生速率，氮蓝四唑氧光化还原法测定超氧化物歧化酶活性，愈创木酚法测定过氧化物酶活性，过氧化氢还原法测定过氧化氢酶活性，紫外吸收法测定抗坏血酸过氧化物酶活性。

7)内源激素：根据王日明和熊兴耀[17]的方法，采用高效液相色谱质谱(HPLC-MS)的方法测定ABA、IAA、GA3和ZR含量。样品的内源激素含量用外标法，激素含量由标准曲线计算得到。

8)抗氧化酶基因表达分析：采用Trizol试剂盒提取黑麦草叶片总RNA，用Nanodrop 2000检测浓度和纯度，用1%琼脂糖凝胶电泳检测完整性。根据 Fermentas cDNA synthesis试剂盒说明书进行反转录合成cDNA。参考TaKaRa公司的SYBR System操作手册，采用ABI7500实时荧光定量PCR仪进行PCR扩增。反应程序为：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性 5 s，52～55 ℃ 退火 20 s，40 个循环。每个处理设3个重复。基因特异性引物为F/R，以eEF1A(s)基因为内参，序列参考Hu等[21]进行合成(表1)。根据得到的Ct值，利用2-△△CT法，分别计算目标基因在不同处理下的相对表达量[22]。

1.4 数据处理与分析

利用 SAS for Window 9.0 软件对试验中的生长速率、草坪质量、电导率、叶绿素含量、活性氧、抗氧化酶活性、激素含量等数据进行方差分析，采用Duncan多重比较检验不同处理间的差异显著性 (P＜0.05)。

2 结果与分析

2.1 外源GABA对高温胁迫下黑麦草生长和草坪质量的影响

正常生长条件下不同浓度外源GABA处理对黑麦草的生长速率和草坪质量无显著影响(P ＞ 0.05)(图1)。高温胁迫显著降低了黑麦草的生长速率和草坪质量(P＜0.05)，但外源施用GABA后不同程度地缓解了因高温胁迫而造成黑麦草生长速率和草坪质量的下降，尤其当GABA浓度为5和10 mmol·L-1时与未施用GABA处理相比，显著提高了生长速率和草坪质量。

表1 试验中所用基因及其引物序列Table 1 Genes and primers used in the experiment

2.2 外源GABA处理对高温胁迫下黑麦草耐热性相关生理指标的影响

2.2.1 对叶片细胞膜稳定性的影响

高温胁迫下黑麦草叶片的相对电导率随着高温处理时间的延长而显著升高(P＜0.05)(图2)，在胁迫处理 7、14和 21 d，电导率显著高于对照 (P＜0.05)，分别比对照增加了1.6、3.4和5.4倍；施用外源GABA后，黑麦草叶片电导率虽然随着处理时间的延长而升高，在胁迫处理7、14和21 d分别是对照的1.2、2.1和3.9倍，但与高温处理下未施用GABA的处理相比显著降低。

2.2.2 对叶绿素含量的影响

高温胁迫下黑麦草叶片的叶绿素含量呈显著下降趋势，在高温胁迫的7、14和21 d，叶绿素含量均较对照显著下降(P＜0.05)，分别比对照下降了84%、63%和43%(图3)；外源施用GABA后则显著缓解了因高温而造成的叶绿素含量的下降，在高温处理后的7、14和21 d，叶绿素含量分别下降至对照的95%(P ＞ 0.05)、80%(P＜0.05)和 63%(P＜0.05)，在高温胁迫下外源施用了GABA的处理叶绿素含量显著高于未施用GABA处理。

2.2.3 对根系活力的影响

高温胁迫下黑麦草的根系活力随着处理时间的延长而显著下降(P＜0.05)，在胁迫处理的7、14和21 d分别下降至对照的81%、59%和36%(图4)；但是外源施用GABA后，黑麦草的根系活力下降程度显著得到缓解，在胁迫处理的7、14和21 d分别下降至正常对照的 91%(P ＞ 0.05)、75%(P＜0.05)和54%(P＜0.05)，在高温胁迫下外源施用了GABA的处理根系活力显著高于未施用GABA的处理。

2.2.4 对活性氧代谢的影响

高温胁迫下黑麦草植株内的活性氧超氧阴离子产生速率和过氧化氢含量均随着处理时间的延长而显著上升 (P＜0.05)(图 5)。在高温处理的7、14 和 21 d，O2·¯的产生速率分别为对照的 1.1、1.46和1.52倍，H2O2含量分别为对照的1.8、3.4和4.7倍。高温胁迫下外源施用GABA后，黑麦草体内的O2·¯的产生速率和H2O2含量均显著低于未施用GABA的处理，表现为在高温处理的7、14 和 21 d，O2·¯的产生速率分别为对照的 1.08、1.2和1.3倍，H2O2含量分别为对照的1.5、2.6和3.9倍。

图1 外源GABA对高温胁迫下黑麦草生长速率和草坪质量的影响Figure 1 Effect of exogenous GABA on the growth rate and turf quality of perennial ryegrass under heat stress同一温度不同小写字母表示不同浓度处理间差异显著(P＜0.05)Different lowercase letters within same temperature indicate significant difference among different concentration treatments at the 0.05 level.

图2 外源GABA对高温胁迫下黑麦草叶片电导率的影响Figure 2 Effect of exogenous GABA on the leaf electrolyte leakage in perennial ryegrass under heat stress不同小写字母表示同一处理不同处理时间间差异显著(P ＜0.05)，不同大写字母表示同一处理时间不同处理间差异显著(P ＜0.05)。 下同。Different lowercase letters within same treatment indicate significant difference between different treatment duratuions at the 0.05 level, and different capital letters indicate significant difference between different treatments in the same duration; similarly for the following figures.

图3 外源GABA对高温胁迫下黑麦草叶绿素含量的影响Figure 3 Effect of exogenous GABA on the leaf chlorophyll content in perennial ryegrass under heat stress

2.2.5 对叶片抗氧化酶活性的影响

在高温胁迫下黑麦草叶片的SOD、POD、CAT和APX活性表现为先升高后下降的趋势(图6)；在胁迫处理7和14 d，4种抗氧化酶的活性均显著高于对照 (P＜0.05)，随后在胁迫处理 21 d 时 4 种抗氧化酶活性与对照差异不显著(P ＞ 0.05)。高温胁迫下外源施用GABA显著提高了黑麦草叶片SOD、POD、CAT和APX活性，在胁迫处理7 d时，施用GABA处理比未施用GABA处理分别提高了29%、21%、22%和16%，胁迫处理14 d分别提高了22%、24%、34%和13%，尤其是在胁迫处理21 d时，分别提高了113%、67%、37%和21%。

2.3 外源GABA对高温胁迫下黑麦草叶片激素代谢的影响

高温胁迫促进了黑麦草叶片ABA的积累，并且随着处理时间的延长积累量显著升高(P＜0.05)(表2)，在高温迫处理7、14和21 d时，ABA含量分别升高至对照的2.2、3.6和6.6倍。常温条件下外源施用GABA对黑麦草叶片的ABA含量较对照无显著影响(P ＞ 0.05)；高温胁迫条件下外源施用GABA较对照显著促进了黑麦草叶片ABA的积累和含量的增加，在胁迫处理7、14和21 d时，ABA含量分别升高至对照的4.3、5.5和9.7倍。

高温胁迫处理下，黑麦草叶片中的IAA、GA3和ZR的含量均随着胁迫处理时间的延长而显著下降 (P＜0.05)(表 2)；在高温处理 7、14 和 21 d，IAA含量分别下降至对照的78%、69%和49%，GA3含量分别下降至对照的67%、35%和12%，ZR含量分别下降至对照的64%、43%和30%。常温条件下外源施用GABA对黑麦草叶片的IAA、GA3和ZR含量无显著影响(P ＞ 0.05)；高温处理下外源施用GABA显著缓解了因高温胁迫而造成的黑麦草叶片IAA、GA3和ZR含量的下降；在高温处理7、14和 21 d、IAA含量仅分别下降至对照的89%、76%和62%，GA3含量分别下降至对照的85%、54%和27%，ZR含量分别下降至对照的74%、55%和44%。

图4 外源GABA对高温胁迫下黑麦草根系活力的影响Figure 4 Effect of exogenous GABA on the root activity in perennial ryegrass under heat stress

图5 外源GABA对高温胁迫下黑麦草超氧阴离子(O2·¯)产生速率和过氧化氢(H2O2)含量的影响Figure 5 Effect of exogenous GABA on the O2·¯ and H2O2 content in perennial ryegrass under heat stress

2.4 外源GABA对高温胁迫下黑麦草抗氧化酶基因表达的影响

高温胁迫下抗氧化酶APX和POD基因(图7A、图7C)的表达水平在处理7 d时上调表达，在胁迫14 d时与对照无显著差异 (P ＞ 0.05)，随后在处理 21 d时表达量显著下调(P＜0.05)，而CAT基因(图7B)的表达水平在高温胁迫下随着处理时间的延长呈下调表达趋势。在常温生长条件下，外源施用GABA对APX、POD和CAT基因的表达水平没有显著影响；但在高温胁迫条件下，与未施用GABA的处理相比，外源施用GABA显著诱导了黑麦草叶片APX、POD和CAT基因的表达，在处理的7 d，分别提高了23%、17%和16%，在处理的14 d，分别提高了39%、28%和43%，在处理的21 d，分别提高了66%、37%和40%。

高温胁迫诱导了SOD基因的上调表达，但不同SOD基因的表达模式不一样。与对照相比，在高温胁迫处理的 7 和 14 d，Cu/ZnSOD(图 7D)，MnSOD(图7E)和FeSOD(图7F)基因均显著上调表达，在胁迫处理的21 d仅MnSOD基因上调表达，而Cu/ZnSOD和FeSOD基因则下调表达。常温生长条件下外源施用GABA对黑麦草叶片的SOD基因的表达水平没有显著影响，但在高温胁迫下外源施用GABA则诱导了抗氧化酶基因的上调表达；与高温条件下未施用GABA的处理相比，在胁迫处理的7、14和21 d，Cu/ZnSOD基因的表达分别上调了6%、16%和35%，MnSOD基因的表达分别上调了18%、20%和5%，FeSOD基因的表达分别上调了12%、18%和42%。

图6 外源GABA对高温胁迫下黑麦草叶片超氧化物岐化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性的影响Figure 6 Effect of exogenous GABA on the SOD, POD, CAT and APX activity in leaves of perennial ryegrass under heat stress

3 讨论

3.1 外源GABA提高了黑麦草的耐高温能力

高温常造成冷季型草坪草生长发育受阻、草坪质量下降、细胞膜透性增大和膜脂过氧化程度增加、叶片枯黄衰老、根系活力下降等生理生化变化[23]。前人研究发现，用外源GABA对番茄[10]、小麦[24]种子进行浸泡可以有效增加发芽率和发芽指数。同时，还有研究发现，外源GABA可提高黄瓜[16]、番茄[11]、玉米[14]对盐胁迫和渍水胁迫的抵抗能力。本研究结果显示，外源施用GABA对高温胁迫下黑麦草的生长速率、草坪质量、细胞膜透性和根系活力的下降均具有很好的缓解作用，这表明外源GABA对黑麦草在高温胁迫下生长的抑制具有缓解作用，施用外源GABA可以显著提高黑麦草的耐高温能力，这与在冷季型草坪草匍匐剪股颖(Agrostis stolonifera)中的研究结果相一致[25-26]。

3.2 外源GABA延缓了高温胁迫下黑麦草植株的衰老

本研究结果显示，高温胁迫下黑麦草叶片枯黄失绿和根系活力下降，表明高温胁迫导致了黑麦草植株的衰老，叶绿体结构和根系吸收能力受到破坏，这与前人在高羊茅(Festuca arundinacea)[27]、剪股颖[28]、仙客来(Cyclamen persicum)[29]、玉米[30]、小麦[31]和水稻(Oryza sativar)[32]的研究结果相一致。高温胁迫下施用外源GABA显著提高了黑麦草的叶绿素含量和根系活力，表明外源GABA缓解了高温对黑麦草叶片和根系的伤害，延缓了植株叶片和根系的衰老，从而有利于维持叶片的光合能力和根系的吸收能力，提高了耐高温能力。

3.3 外源GABA提高了高温胁迫下黑麦草的抗氧化能力

本研究结果显示，高温胁迫下黑麦草体内的ROS产生速率和含量以及电导率显著升高，并且随着胁迫时间的延长而加剧，表明高温胁迫下黑麦草植株细胞内受到了氧化伤害。王晓冬等[14,33]研究表明GABA可通过调节抗氧化酶系统来增强小麦的耐热性和耐涝性；杨丽文等[34]研究认为，低氧胁迫下外源GABA能显著提高甜瓜( Cucumis melo)幼苗叶片SOD、CAT、APX、GR等抗氧化酶的活性。高温条件下施用外源GABA后，黑麦草叶片内的SOD、POD、CAT和APX基因的表达水平显著上调，同时SOD、POD、CAT和APX活性也显著升高，O2·¯和H2O2等ROS水平显著降低，表明高温下施用GABA可诱导抗氧化酶基因的上调表达，从而提高多个高抗氧化酶活性共同组成体内的保护酶系统来清除体内过量的ROS，促进黑麦草细胞胞内ROS代谢平衡，提升细胞膜结构的稳定性，从而缓解高温胁迫对植株造成的伤害，增强黑麦草的耐热性。

表2 外源GABA对高温胁迫下黑麦草叶片内源激素含量的影响Table 2 Effect of exogenous GABA on endogenous hormones content in the leaves of perennial ryegrass under high temperature stressng·g-1

3.4 外源GABA提高了高温胁迫下黑麦草的激素代谢水平

植物对外界环境的抵抗能力常受植株内源激素的调控，与植物对环境胁迫的适应性密切相关[35]。本研究前期[16]及本研究结果均表明，在高温处理下黑麦草叶片ABA含量均随着胁迫时间的延长而显著提高，而GA3、IAA和ZR含量均随着胁迫时间的延长而显著降低，这与前人的研究[36-37]结果一致。高温胁迫下维持较高的内源激素水平，不仅可以诱导或增加抗性基因的表达而增强植物对高温的适应能力，还可以提高SOD等膜保护酶的活性，直接或间接地清除自由基，减轻因逆境胁迫产生的氧自由基对细胞膜系统造成的伤害和延缓逆境胁迫下叶片的衰老，从而提高了黑麦草的耐高温能力。

图7 外源GABA对高温胁迫下黑麦草叶片抗氧化酶基因表达的影响Figure 7 Effect of exogenous GABA on the expression level of antioxidant enzyme genes in the leaves of perennial ryegrass under heat stress

4 结论

通过在高温条件下外源施用GABA对多年生黑麦草的生长和草坪质量, 细胞膜的稳定性, 叶绿素含量, 根系活力, 活性氧水平, 抗氧化酶活性及其基因的表达, 内源激素ABA、GA3、IAA和ZR含量等指标的测定分析表明，外源施用GABA能有效提高黑麦草的耐高温能力，这与GABA诱导了抗氧化酶基因的上调表达，提高了抗氧化酶的活性从而有效清除和降低细胞内的活性氧，减轻了由高温胁迫造成的氧化伤害，稳定了细胞膜系统密切相关；此外，高温下施用GABA后植株内维持较高的促进生长类激素IAA、GA3和ZR有助于缓解因高温和呼吸增强导致的叶片枯黄衰老和根系活力的下降，进而提高了黑麦草的抗高温能力。