刘利民,姚松梅,李 洋*

(1.正大天晴药业集团股份有限公司南京研究院，江苏 南京 210023;2.南京中医药大学药学院，江苏 南京 210023 )

老鹳草为牻牛儿苗科植物牻牛儿苗Erodium stephanianum Wild、老鹳草Geranium wilfordii Maxim，或野老鹳草Geranium carolinianum L.的干燥地上部分。其味辛、苦，性平，具有祛风湿，活血，止泻痢等功效，可用于治疗筋骨疼痛，痹症，麻木，泄泻痢疾等病症[1]。鞣质和黄酮类是其重要药效成分，鞣质是一种多元酚类化合物，此类化合物具有收敛、抑菌、抗病毒、抗氧化、降血压等作用[2]；黄酮类天然产物，具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、降血糖等作用。因此，开发利用老鹳草的药用植物资源，优化老鹳草总鞣质与总黄酮的提取工艺，对扩大其应用和工业化生产具有现实意义。目前，对鞣质与总黄酮的提取多采用超声和回流提取，多数对溶剂的浓度与用量、提取时间、液料比、提取温度等进行考察研究。本文总结了提取鞣质和总黄酮的多种工艺方法，以期为更好地开发利用老鹳草资源奠定基础。

1 鞣质的提取

鞣质的提取方法有多种，主要有回流提取法、纤维素酶酶解法、水温浸法、超声提取法、超临界CO2提取法。以相关物质的提取率为指标，考察对提取率产生影响的各因素，从而确定最佳提取工艺。

1.1 回流提取法

尹海波等[3]比较了乙醇热回流、乙醇冷浸及甲醇超声三种提取方式，发现从提取效率和节约成本的角度，乙醇热回流方法最优。采用正交设计法，以没食子酸的提取率为考察指标，考察对提取率产生较大影响的四因素，即乙醇的浓度与用量，提取次数与提取时间，最终确定提取工艺为30倍30%乙醇提取3次，每次1h。通过设计验证性试验，发现使用该提取工艺后，鞣质的提取效率较高，操作可控，节省物料。而辛聪等[4]以紫外分光光度法测定的鞣质含量为指标，调整提取温度，采用均匀设计试验考察乙醇浓度、提取时间、提取温度和乙醇用量四因素，用回流法提取老鹳草中的鞣质。优选出最佳提取工艺为乙醇浓度40%，提取两次，溶剂用量24倍(12倍、12倍)，提取时间6h(3h，3h)，提取温度80℃，老鹳草中鞣质的提取量为3.498%。李京杰等[5]通过单因素试验研究鞣质提取率的影响因素，包括提取温度、提取时间、料液比、乙醇浓度等。利用中心组合试验设计对老鹳草总鞣质提取工艺条件进行优化，采用三因素三水平响应面试验设计优化出老鹳草总鞣质的最佳提取工艺条件为：老鹳草粉末与71%乙醇的比例1∶18于83℃恒温回流2h，提取3次，鞣质的提取率为13.55%，与之前鞣质提取率相比有了提高。谷静逸等[6]用50%甲醇、水、75%乙醇作为考察溶剂，采用回流的提取方式，设计了3种实验方案：50%甲醇回流2次；水回流2次；75%乙醇回流1次与水回流1次混合。结果表明，75%乙醇和水各回流1次后既能使老鹳草素水解完全，又能让样品中诸如柯里拉京、没食子酸成分的含量不被降低，所以采用75%乙醇+水各回流提取1次后混合提取鞣质。与谷静逸选择的提取方法相反，李祎等[7]选择水回流提取，而且该工艺明显提高了主要活性成分总鞣质的提取率，总鞣质提取率高达25.29%。实验不仅仅将总鞣质含量作为考察指标，还将浸膏得率和柯里拉京含量纳入考察依据，对影响因素如提取的溶剂、温度、时间、次数以及加水量等进行考察，确定老鹳草总鞣质的最佳提取工艺为：老鹳草粉末+20倍量的水于100℃下回流2h，回流两次。

1.2 酶解法

酶解法在工艺操作、工艺成本、设备要求等方面都优于有机溶剂提取中药成分。酶解法适用于工业化大生产，并且酶解法提取率高。郑玲玲等[8]以用比色法测定的鞣质含量为评价指标，用纤维素酶酶解法提取老鹳草中的鞣质。将纤维素酶用量、酶解时间和酶解温度作为考察因素，进行正交设计实验。最终确定的最佳提取工艺为：酶用量为10U/g，酶解温度为60℃，酶解时间为60min。在不加酶的情况下，按照工艺条件进行水提取，结果根据吸光度值可判断酶解法优于水提法。

1.3 水温浸法

鞣质的极性较强，所以提取溶剂选择极性较大的水和有机溶剂。阎巧娟等[9]采用水回流法、水温浸法、丙酮回流法、冷浸搅拌法和乙醇回流法提取老鹳草中的鞣质。水回流较水冷浸提取率高，但鞣质遇热易氧化变性，所以水回流不适合作为提取鞣质的最佳方法。采用水温浸法、丙酮回流法和乙醇回流法提取的鞣质的含量都较高，但水温浸法具有经济优势，所以最终将水温浸法作为提取鞣质的最佳方式。王放银等[10]通过正交试验确定影响鞣质提取的主要因素为料水比，其次是浸提温度，最后是浸提时间，优选出最佳工艺条件为：料水比1∶30、浸提温度80℃、浸提时间30min。

1.4 超声提取法

与传统的温浸提取法相比，循环超声法提取率高，提取时间短，溶剂用量少。郑明昱等[11]采用干酪素法测定鞣质含量，考察提取溶剂、提取时间、超声功率等因素对鞣质提取率的影响，确定工艺条件为12倍量40%乙醇超声提取1h，间隔超声比0.6∶0.5s，超声功率500W，并且设计温浸提取对比试验，结果鞣质提取率明显低于该超声提取法。鞣质提取后需要进行分离纯化，减压分离提取溶剂。因为鞣质极性强且50℃以上易氧化，因此应该采用沸点低且同样具有较强极性的溶剂，所以史伟国等[12]选择极性强、沸点低的丙酮作为提取溶剂。将老鹳草粉末置于丙酮溶液中浸泡后于常温下超声，提取鞣质。考察丙酮的适宜浓度及用量，浸泡和提取的时间，以总鞣质含量为指标，用EDTA络合法滴定。最终从耗时和节能的角度选定提取工艺为：用30%丙酮10倍量浸泡12h超声提取60min。郑玲玲等[13]利用明胶沉淀老鹳草中总鞣质，再利用丙酮溶解明胶沉淀物中总鞣质，初步纯化出老鹳草中总鞣质类成分。也有学者采用12%交联琼脂糖凝胶吸附色谱法一步分离纯化了老鹳草中可水解的鞣质，采用5%乙醇和5%乙酸组成的流动相A和30%乙醇和30%乙酸组成的流动相B梯度洗脱法进行分离，纯度及产率都较高[14]。

1.5 超临界CO2提取法

有学者为了优化超临界CO2提取老鹳草中鞣质的工艺条件，用磷钼钨酸-干酪素比色法测定鞣质的含量，以老鹳草鞣质的提取含量为指标，考察提取压力、提取温度和提取时间三个影响因素，通过正交试验对工艺条件进行了优化。确定最佳工艺条件为：提取压力25MPa，提取温度为500℃，提取时间为1.5 h[15]。

2 总黄酮的提取

黄酮类化合物一般难溶或不溶于水，可溶于甲醇，乙醇等有机溶剂，所以总黄酮的提取多用乙醇作为提取溶剂。目前老鹳草总黄酮的提取可采用回流提取法、超声提取法、乙醇渗漉法、微波辅助乙醇萃取法。

2.1 回流提取法

王洪成等[16]采用先水回流再乙醇回流的方法使老鹳草素充分水解同时又可提取出黄酮类成分。朱明慧等[17]通过星点设计-效应面法优化老鹳草总黄酮的提取工艺。以总黄酮得率为指标，用单因素试验考察乙醇体积分数、回流时间、溶剂用量和提取温度四因素，在单因素试验基础上，根据星点设计原理优化出总黄酮的提取工艺为：加35倍量65%乙醇于90℃回流提取2次，每次70min。尹海波等[18]比较了超声提取法、乙醇冷浸法、乙醇回流法，结果超声提取法、乙醇冷浸法和乙醇回流法所得样品中总黄酮的平均含量依次为0.0964%、0.0906%、0.4687%。相比而言乙醇回流提取的总黄酮得率较高，所以采用乙醇回流法设计正交试验。以老鹳草药材总黄酮的提取率为指标，考察对总黄酮提取率产生较大影响的四因素：乙醇浓度及其用量，回流时间和回流次数，最终将提取工艺优化为4倍量90%乙醇提取3次，每次1h。杜列勇等[19]首先确定了提取所用的乙醇浓度为60%，在确定醇浓度的基础上，依据总黄酮的提取量，选择乙醇用量、提取时间和提取温度为考察因素，再设计正交试验确定提取总黄酮的最佳工艺条件为：老鹳草粉末加20倍量的60%乙醇于80℃下回流75min。在预试中发现，一定时间内，提取出的有效成分随着时间的增加而增加，提取出的杂质也随时间的增长而相应增多。一定时间过后，总黄酮提取率不再明显增加但杂质仍继续增多，所以为了便于提取后的分离纯化，选择回流75min。经过试验验证，该工艺条件可行且可以作为大生产的参考工艺条件。

2.2 超声提取法

周庆颂等[20]采用乙醇超声提取总黄酮，比较了30%～90%乙醇等不同提取溶剂，发现70%乙醇超声提取黄酮的总含量较高且干扰杂质最少，所以用70%乙醇作为提取溶剂，超声提取总黄酮。但是也有学者认为60%乙醇提取总黄酮的量相对较多，刘青林等[21]先对所用溶剂进行了50%、60%、70%、75%、80%五个乙醇浓度对比研究，发现用60%乙醇提取总黄酮的量较多，溶液杂质较少，所以确定选用60%乙醇提取。之后刘青林等比较了回流、超声、渗漉这三种提取方式，发现超声法提取的总黄酮量较多且从操作的角度考虑，超声法提取总黄酮操作更为方便。

2.3 乙醇渗漉法

秦哲等[22]为了获得经济实用的老鹳草中黄酮类物质的提取方法，以乙醇为提取溶剂，分别运用渗漉法与超声提取法提取老鹳草中总黄酮类化合物，用比色法测定总黄酮含量，并对两种提取方法进行了比较。虽然试验结果与刘青林所下的结论一致，超声提取法提取的总黄酮的量高于渗漉法，但综合提取效率、提取成本等因素，秦哲等认为乙醇渗漉法更适合老鹳草总黄酮的提取。

2.4 微波辅助乙醇萃取法

微波萃取技术不同于传统萃取技术，它速度快，往往只需要几分钟，提取率高且试验结果重现性好。赵志添等[23]将过筛的老鹳草粉末置于一定量的乙醇溶液中萃取，将提取液在一定的微波功率下微波处理一段时间，过滤完全后，用明胶沉淀法除去滤液中的鞣质，得到总黄酮。先进行单因素试验，以确定适宜的乙醇浓度、液料比以及微波参数如功率、时间等。实验结果表明，乙醇浓度在40%～90%时，总黄酮得率先增后减，在乙醇浓度为70%时，总黄酮得率最高；液料比在10～30mL/g时，总黄酮得率先明显增加，液料比到达20mL/g后再增加液料比，总黄酮得率增加不明显，接近平稳，所以液料比在20mL/g时既能节省物料又能使提取出的总黄酮的量接近最多；随着微波功率的增大，总黄酮得率先升后降，微波功率在385W时，总黄酮得率为最大值；虽然微波时间延长可能会使反应更加完全，总黄酮的提取率升高，但是超出合适的微波时间后，提取液会喷溅从而造成损失，微波时间处于2min时可使提取率达到最高。再设计正交试验，以确定对总黄酮得率产生影响的因素的主次。最终确定的最佳工艺条件为乙醇浓度70%，液料比20mL/g，微波时间2min，微波功率385W。

3 总结与展望

老鹳草在我国资源丰富，分布广泛，其主要活性成分鞣质和总黄酮的提取方法有多种，即使提取方式相同，选用的提取溶剂浓度用量、提取时间、提取次数、提取温度不同，也会造成提取率的不同。就回流提取法提取鞣质而言，影响因素的选择不同，就会造成鞣质得率3.498%、6.32%、13.55%、25.29%的差异。因此，不仅要考察提取方式也要重视影响因素的考察研究。先进提取技术的发展，将极大地提高老鹳草鞣质与总黄酮的提取效率，提取工艺的不断优化也将使老鹳草具有良好的应用前景。