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三磷酸腺苷对后肢制动大鼠比目鱼肌离体单一肌梭电生理活动的影响

2019-02-15赵雪红樊小力李雪萍

生物学杂志 2019年1期
关键词:后肢肌萎缩腺苷

余 蕾,赵雪红,樊小力,李雪萍

(1.西安医学院,西安710021;2.湖北文理学院 医学院机能学部,襄阳 441053;3.西安交通大学医学部,西安 710016)

制动、失重等条件下骨骼肌发生萎缩,这种由于运动减少、缺乏锻炼所致的肌肉萎缩称为废用性肌萎缩。中长期的航天飞行过程中宇航员会出现肌肉萎缩尤其是下肢抗重力肌的萎缩,这极大地限制了宇航员在太空中的作业,待其返回地面后,萎缩的肌肉无法立即恢复正常,并且容易出现站立不稳、平衡失调等情况,严重影响宇航员的生活[1-2]。对于骨折患者的制动治疗虽然可保护受损组织利于骨折的愈合,但限制了周围健康关节、肌肉的运动,可导致明显的肌肉萎缩。废用条件下肌紧张减弱,大鼠出现肌肉萎缩,其中肌梭的萎缩比梭外肌出现的要早,其萎缩程度也较梭外肌更为严重,这提示肌梭在废用性肌萎缩的发生发展过程中起着举足轻重的作用[3-5]。研究发现,蟾蜍离体单一肌梭在肌苷的作用下,其自发放电可明显增多[6]。到目前为止,以大鼠单一肌梭作为研究对象,观察在废用性肌萎缩发生过程中药物对肌梭放电的影响尚未见报道。本研究通过建立后肢制动模型导致大鼠出现废用性肌萎缩,而后记录大鼠比目鱼肌离体单一肌梭的电生理活动,并分别观察不同剂量的三磷酸腺苷(1、2和3 mg/kg)对肌梭电生理活动的影响,为废用性肌萎缩的预防与治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物与药品

实验选取雄性SD大鼠作为研究对象(购自西安交通大学实验动物中心),体重200~220 g。按体重配对原则随机将大鼠分为5组,即正常对照组(CON)、后肢制动组、后肢制动+1 mg/kg三磷酸腺苷钠组(Na2ATP 1)、后肢制动+2 mg/kg三磷酸腺苷钠组(Na2ATP 2)、后肢制动+3 mg/kg三磷酸腺苷钠组(Na2ATP 3),每组5只。氯化琥珀胆碱注射液(1 g/2 mL),购自上海旭东海普药业有限公司。Na2ATP注射液(10 mg/1 mL),购自辽宁可济药业有限公司。

1.2 大鼠后肢制动模型建立

实验采用改良Booth等的方法[7]建立大鼠后肢制动模型。大鼠经0.4 g/kg水和氯醛腹腔注射麻醉后清洁其左后肢,在左后肢上包裹一层轻薄的棉花,尤其注意关节及血管等处防止这些部位受到石膏压迫,而后将石膏绷带置于棉花上缠绕包裹左后肢,绷带松紧适宜,由踝关节起向上经膝关节缠绕至腹股沟处,注意固定过程中膝关节处于伸展状态,踝关节处于背伸状态,最终使左后肢固定于静息位一周。石膏外侧包绕铜网,防止动物撕咬。室温维持在25℃左右,将大鼠置于鼠笼内喂养,一鼠一笼,保证大鼠正常饮水进食以及活动。

1.3 大鼠比目鱼肌单一肌梭标本的制备

腹腔注射戊巴比妥钠(45 mg/kg)麻醉大鼠,取后肢比目鱼肌置于改良任氏液(CaCl2浓度为 1.8 mol/L)中,水浴37℃,持续通氧。肌梭与梭外肌并联,外观呈梭形,以此作为标志,在双目解剖显微镜和倒置显微镜下寻找肌梭。沿肌纤维走形方向,使用分离针小心剥离肌梭周围的结缔组织和梭外肌。分离过程注意保护肌梭梭囊的完整,并保留至少3 mm的传入神经纤维。为保证肌梭活性,整个分离过程不超过10 min,超时仍未分离出肌梭则需更换新的比目鱼肌及改良任氏液重新分离。

1.4 单一肌梭电活动记录

实验采用空气隔绝法[8]记录单一肌梭传入放电。将制备好的肌梭标本放入屏蔽箱内通氧平衡10 min,CON组及后肢制动组记录肌梭自发传入放电;而后给予50 mg/L Sch灌流,记录肌梭诱发放电情况。后肢制动+Na2ATP 1、后肢制动+Na2ATP 2、后肢制动+Na2ATP 3给予相应浓度的Na2ATP灌流,记录肌梭自发传入放电;而后给予50 mg/L Sch灌流,记录肌梭诱发放电情况。

1.5 数据采集与统计分析

表1 后肢制动一周对大鼠比目鱼肌离体单一肌梭放电变化Table 1 The influence of hindlimb immobilization for one week on the discharges of isolated soleus muscle spindle in rats

*:P<0.05,compared with CON;△:P<0.05,compared with the electrical activity of muscle spindle before administration of Sch

2 结果

2.1 后肢制动一周大鼠比目鱼肌单一肌梭放电变化

实验记录了正常对照组及后肢制动组各12例肌梭自发及诱发放电情况,结果显示后肢制动一周后大鼠比目鱼肌离体单一肌梭传入放电形式与正常对照组一致,均为簇状放电,簇状放电之间间隔一定的周期。然而后肢制动组放电频率较正常对照组明显减少(P<0.05),放电周期间隔延长明显(P<0.05),给予50 mg/L Sch后诱发放电未见明显增多。

2.2 三磷酸腺苷对后肢制动大鼠比目鱼肌单一肌梭放电的影响

实验观察并记录了分别给予Na2ATP 1、2和3 mg/kg后,后肢制动大鼠比目鱼肌单一肌梭放电的变化,每组记录12例肌梭放电。

2.2.1 自发放电变化

平均频率:给予1 mg/kg Na2ATP灌流后肌梭传入放电平均频率为(0.08±0.01)Hz,较给药前制动大鼠平均频率(0.07±0.01)Hz未见明显变化;给予2 mg/kg Na2ATP灌流后肌梭传入放电平均频率由(0.08±0.01)Hz增至(0.14±0.01)Hz(P<0.05);给予3 mg/kg Na2ATP灌流后肌梭传入放电平均频率由(0.07±0.01)Hz增至(0.15±0.01)Hz(P<0.05)。

峰值频率:给予1 mg/kg Na2ATP灌流后肌梭传入放电峰值频率为(6.30±1.85)Hz,较给药前制动大鼠峰值频率(5.62±1.03)Hz未见明显变化;给予2 mg/kg Na2ATP灌流后肌梭传入放电峰值频率由(4.80±0.87)Hz增至(8.53±1.22)Hz(P<0.05);给予3 mg/kg Na2ATP灌流后肌梭传入放电峰值频率由(5.61±0.79)Hz增至(9.94±1.05)Hz(P<0.05)。

周期间隔:给予1 mg/kg Na2ATP灌流后肌梭传入放电周期间隔为(4.08±1.03)min,较给药前制动大鼠自发放电周期间隔(4.79±0.89)min未见明显改变;给予2 mg/kg Na2ATP灌流后肌梭自发放电周期间隔由(4.66±0.72)min缩短至(4.08±1.03)min;给予3 mg/kg Na2ATP灌流后肌梭传入放电自发放电周期间隔由(4.71±0.83)min缩短至(2.96±0.94)min(P<0.05)。

2.2.2 诱发放电变化

各组给予50 mg/L Sch灌流观察其诱发放电情况,结果显示,Na2ATP 1组中仅2例肌梭放电增加,诱发阳性率为16.7%。诱发放电的平均频率为(0.08±0.01)Hz,峰值频率为(7.80±2.57)Hz,自发放电的周期间隔为(4.15±1.21)min;Na2ATP 2组中仅3例肌梭放电增加,诱发阳性率为25%。诱发放电的平均频率为(0.16±0.01)Hz,峰值频率为(10.37±1.89)Hz,自发放电的周期间隔为(3.74±0.94)min;Na2ATP 3组中6例肌梭放电增加,诱发阳性率为50%。诱发放电的平均频率为(0.24±0.01)Hz(P<0.05),峰值频率为(15.18±1.64)Hz(P<0.05),自发放电的周期间隔为(2.81±0.75)min。

A:平均频率;B:峰值频率;C:放电周期间隔。*:P<0.05,compared with hindlimb immobilization;Δ:P<0.05,compared with before the administration of Sch

图1 Na2ATP对后肢制动大鼠单一比目鱼肌肌梭传入放电的影响
Figure 1 Effects of Na2ATP on the afferent discharges of hindlimb immobilization rat′s soleus muscles′ single spindles

3 讨论

肌梭是骨骼肌内的本体感受器,它与梭外肌平行排列,位于初长度时肌梭可产生自发的传入放电。在重力的作用下,肌梭自发传入放电不断传向中枢,从而产生了肌紧张,使地球上的人和动物维持站立的状态。失重和制动均可使骨骼肌活动减少,最终导致废用性肌萎缩的发生。既往研究发现模拟失重情况下在体肌梭传入放电明显减少[3],肌紧张减弱,梭内内肌与梭外肌均萎缩,且肌梭发生萎缩的时间早于梭外肌。然而在体条件下,肌梭与梭外肌纤维并联,梭外肌收缩导致肌梭缩短,传入放电减少;且梭内肌纤维受来自脊髓前角的γ-运动神经元支配,而γ-运动神经元则受到高位中枢功能状态的调控[9],为排除上述影响因素,本实验采用空气隔绝法记录离体单一肌梭放电,单纯观察后肢制动对肌梭传入放电的影响并寻找相应的有效对抗措施。

本实验建立了大鼠后肢制动模型,发现后肢制动一周大鼠比目鱼肌离体单一肌梭自发放电频率较正常明显减少,肌梭簇状放电的周期间隔延长,且对兴奋肌梭的药物Sch无明显反应,这与赵雪红等人[10]对模拟失重情况下在体肌梭放电减少的研究结果一致。分别给予1、2和3 mg/kg 3种浓度的Na2ATP灌流后肢制动7 d的大鼠比目鱼肌的离体单一肌梭,结果发现,一定浓度的三磷酸腺苷可兴奋肌梭,使其自发放电明显增加,然而仅较高浓度的三磷酸腺苷可使诱发放电明显增加。

三磷酸腺苷兴奋肌梭可能与以下因素有关:1)研究表明模拟失重仅3 d,梭内、外肌细胞即出现了胞浆游离Ca2+浓度增多的现象;模拟失重14 d,梭内、外肌细胞胞浆出现钙超载现象,并可见到梭内肌纤维中钙结合蛋白D28K的表达明显减少,D28K与胞浆游离Ca2+的结合减弱,胞浆游离Ca2+增多[11]。废用性肌萎缩发生时细胞可出现钙超载,三磷酸腺苷作为能量补充剂,一方面经ATP酶水解后可促使肌丝滑行,梭内肌纤维收缩,肌梭传入冲动增多;另一方面可加快肌浆网对Ca2+的摄取,提高梭内肌纤维的舒张速度。2)在三磷酸腺苷的作用下,神经肌肉接头处突触前膜内的递质乙酰胆碱释放增多,乙酰胆碱扩散至终板膜与其受体结合,可提高终板膜对Ca2+的通透性,触发Ca2+内流[12]。Ca2+内流一方面可触发核袋纤维收缩,肌梭传入放电增多;另一方面可降低梭内肌细胞膜电位水平,产生感受器电位[13],提高梭内肌纤维的兴奋性,从而使肌梭传入放电增多。3)另有研究表明,当被称为肿瘤抑制器的叉头转录因子FoxO3a活化时,MAFbx 表达上调,从而引起肌萎缩。外源性ATP可促使FoxO3a磷酸化,MAFbx表达下调,起到缓解肌萎缩的作用[14-15]。

制动情况下肌肉发生萎缩,肌梭自发放电减少,传向中枢的神经冲动减少,肌紧张减弱,最终导致或加重了肌肉萎缩[16-17]。到目前为止尚未发现对抗废用性肌萎缩的较好的方法,本实验采用空气隔绝法测单一肌梭放电,结果显示后肢制动一周单一肌梭传入放电明显减少,给予一定浓度的三磷酸腺苷可对抗肌梭传入放电减少的情况,其对抗肌萎缩的机制还有待于进一步研究。本研究结果为大鼠肌梭生理的研究与废用性肌萎缩的实验研究中提供了有意义的资料,为制动所致肌萎缩的防治提供新的实验依据。

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