于新友，李天芝

（山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600）

大部分病原微生物都是通过黏膜途径入侵动物机体，引起感染和发病，健康动物的黏膜可通过各种方式，发挥作用，抵御病原微生物的入侵，这些黏膜分布在与外界相通的呼吸道、消化道、泌尿生殖道等表面[1-2]。黏膜及其周围外分泌腺体的淋巴组织、全身血液和淋巴循环构成机体的黏膜免疫系统，同细胞免疫和体液免疫一样发挥黏膜免疫功能，增强机体防病、抗病力[3-4]。黏膜免疫自出现以来，受到广泛重视，与传统体液和细胞免疫不同，黏膜免疫系统不仅局部产生具有分泌型的抗体，如分泌型的IgA（sIgA）、IgM（sIgM）和IgG等，在局部发挥作用阻断病原入侵，还能促使全身黏膜免疫系统共同发挥作用，诱发全身免疫应答[5-6]。通常黏膜局部抗体出现时间比血清抗体早，持续时间长、效价高。

随规模化养猪业的不断发展，传统注射免疫方式劳动强度大，需大量人力、物力，易交叉污染，造成猪只应激，急需采用新的免疫方式。黏膜免疫可通过气雾、口服等途径接种，对猪损害小，操作简单，并能通过占位效应阻止病原在机体黏膜定植，发挥局部及全身免疫应答作用。近年来，黏膜免疫受到广泛关注，是未来猪病免疫的主要方向。要想达到理想免疫效果需根据不同病原的入侵途径，有针对性地进行研制相应疫苗，并配合专属黏膜免疫佐剂，使得通过黏膜途径免疫的疫苗发挥最大作用，更好地保护猪只健康。现就猪各种疾病黏膜免疫疫苗的研究进展进行综述，以期为保护猪只健康提供思路。

1 猪流行性腹泻

猪流行性腹泻病毒（PEDV）对哺乳仔猪的危害严重，尤其对7日龄仔猪，因肠上皮细胞更新速度慢，死亡率更高，通过母乳获得的sIgA是仔猪抵抗病毒感染的关键。传统的母猪肌注灭活疫苗不能产生sIgA，而接种弱毒疫苗后可能会因弱毒含量低或在肠道中的增值能力低或与当前流行毒株不匹配等问题，不能产生大量的sIgA，免疫效果差。而口服疫苗免疫可刺激母猪乳腺产生sIgA，sIgA在肠道中稳定性较好，可为仔猪提供被动免疫保护。Hou等构建了能表达PEDV N基因的重组乳酸杆菌，经口服和滴鼻免疫小鼠后，通过测定血清中的抗体IgG的含量来判定免疫效果，结果显示，与对照组相比无论是口服免疫还是滴鼻免疫组小鼠，免疫效果几乎无差别，都能产生良好的免疫应答反应；在免疫后70 d采集小鼠肠液，并在84 d收集小鼠肺液，分别用间接ELISA方法检测黏膜抗体IgA的含量，结果表明，肠液和肺液中均能检测到高含量的抗体水平，且这些抗体具有中和PEDV的活性[7]。葛俊伟等构建了表达PEDV COE基因的重组乳酸杆菌口服免疫小鼠，测定其免疫应答水平，结果表明，免疫组小鼠血清、粪便中检测到较高水平的特异性IgG、sIgA（P＜0.01），血清具有中和活性（1∶12），脾淋巴细胞增殖指数明显高于对照组，IL-4和IFN-γ水平极显著提高（P＜0.01）[8]。

2 猪传染性胃肠炎

猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）是经肠道黏膜感染的重要病毒，黏膜免疫在抵御病毒侵入机体过程中具有重要作用。宋振辉等分别构建了含TGEV M及N基因的重组杆状病毒rBac-M和rBac-N，将两种重组病毒分别口服免疫小鼠，收集小鼠粪便检测sIgA抗体水平，并检测血清中IgG，结果显示，这两种不同的重组病毒分别免疫小鼠后，均可以诱导小鼠机体产生良好的体液和黏膜免疫应答反应[9]。刘义等将含有TGEV S基因的重组乳酸菌口服（灌胃）免疫BALB/C小鼠，首免、二免、加强免疫共免疫3次，每次免疫连续灌服3 d，间隔两周，免疫剂量为0.3～0.4 mL·只-1，第3次加强免疫后10 d，捕杀小鼠，采集血液、脾脏、粪便，处理后采用T淋巴细胞增殖试验及间接ELISA方法检查免疫小鼠对外源基因表达产物的应答情况，结果表明，免疫组小鼠血清中的IgG、粪便中的sIgA与对照组有显著差异（P＜0.05）[10]。

3 猪轮状病毒病

轮状病毒可引起各种幼龄动物腹泻，也能导致婴幼儿发病，是一种人兽共患病原体。对轮状病毒感染所引起的胃肠炎没有特效治疗药物，只能通过疫苗免疫预防。目前，人用的轮状病毒疫苗可口服免疫，效果较好，猪轮状病毒口服疫苗的研制是疫苗研究的重要方向。叶丽萍等构建了能表达轮状病毒Vp4的重组乳酸菌，大量培养后离心，加入灭菌脱脂乳液给BALB/c小鼠灌服，检测血清抗体和肠黏膜sIgA水平，并进行小鼠免疫保护性试验，结果表明，该重组菌能增强小鼠的黏膜免疫反应，对猪轮状病毒强毒株的攻击具有一定的保护作用[11]。

4 猪伪狂犬病

由于伪狂犬病病毒并不引起毒血症，而主要定植在三叉神经，使用gE缺失的弱毒疫苗局部黏膜免疫可以起到占位效应，从而抵抗野毒的感染。同时，黏膜免疫可以避免母源抗体对免疫产生的影响。用猪伪狂犬病病毒活疫苗在小猪1～3日龄喷鼻免疫，是猪场伪狂犬病净化的第1步，能有效抵御伪狂犬病野毒的入侵。喷鼻免疫一定要操作正确，选用专用的喷鼻器，最好不要进行滴鼻免疫，滴鼻时只有非常少的疫苗粘在鼻腔黏膜，大部分疫苗或通过吞咽反射进入胃内被胃酸灭活或直接流出，不能有效利用，如果能配合相应的佐剂则能进一步提高黏膜免疫的效果。猪场在喷鼻免疫的基础上再做1～2次肌肉注射免疫以建立细胞免疫，防控伪狂犬病。

5 猪支原体病

猪支原体能与相应的受体结合，并在黏膜部位的细胞内增殖，通过“占位效应”阻断野毒的“入侵”。猪支原体活疫苗可喷鼻免疫，也可进行喷雾免疫操作，当喷雾免疫时一定要控制气溶胶颗粒的大小，颗粒太大时，仅能到咽部，不能进入气管及肺部，太小时，即使吸入体内也容易呼出，只有大小合适的颗粒才能在进入肺部并停留。另外，喷雾时一定要保持抗原的活性，否则就失去意义。气雾免疫能否取得良好的效果，取决于两个关键因素，即如何保证喷雾颗粒的大小合理及微生物活性的保持。郑鹏等用猪肺炎支原体活疫苗免疫健康家兔，并添加相应佐剂以增强免疫效果，结果显示，家兔免疫后均能产生良好的体液、细胞及黏膜免疫应答反应，尤其以CPG佐剂组效果最好[12]。

6 猪圆环病毒病防控

圆环病毒2型（PCV2）可经呼吸道、消化道、精液及胎盘等途径传播，能定植于黏膜系统（包括口鼻呼吸道、支气管、肺及胃肠道黏膜）然后开始复制，并突破血液屏障进入血液循环和淋巴循环。传统的圆环病毒2型疫苗肌肉注射，只能获得体液免疫，无法阻止PCV2在黏膜系统的定植复制及向体外排毒，黏膜免疫产生sIgA可通过黏膜免疫中和病毒，全面清除机体中的病毒。英国皇家科学院用食用酵母菌为载体研制了圆环的口服疫苗为粉末状风干重组酵母，可稳定地表达PCV2b的壳蛋白，在母猪肠道建立了黏膜保护，从而显著降低猪只体内病毒含量，减少排毒，减轻临床症状，使得粪便中IgA抗体和血清中IgG抗体水平显著提高，从而降低了母猪圆环病毒2型的排毒感染压力。

7 猪蓝耳病防控

猪蓝耳病病毒（PRRSV）可经呼吸道、消化道、生殖道等黏膜途径感染猪，通过黏膜免疫可阻断其感染。吴国军等研究表明，通过鼻腔黏膜途径接种PRRS疫苗弱毒CH-1R株能显著刺激动物机体产生良好的体液和黏膜免疫应答反应，从而对动物机体产生良好的保护作用[13]。Han等构建了表达PRRSV的ORF7基因重组减毒沙门氏菌，经口服免疫小鼠12周后，在肠系膜淋巴结、小肠黏膜下淋巴集结、固有层淋巴细胞都检测到sIgA[14]。王振华等构建了表达PRRSV ORF6基因的重组乳酸杆菌，与黏膜佐剂CpG ODN联合鼻内免疫BALB/c小鼠，评价其佐剂效应，结果表明，与单独免疫佐剂和抗原组相比，免疫抗原配合CpG ODN佐剂组，血清中产生较高的IgG抗体水平，且呼吸道黏膜和肠道黏膜也能产生较高的sIgA水平抗体水平，其中呼吸道黏膜的sIgA水平抗体水平高于肠道黏膜。通过测定脾细胞悬液中细胞因子，比较各组细胞免疫效果，结果显示，疫抗原配合CpG ODN佐剂组的IL-2、IFN-γ和IL-5活性均高于单独免疫组（P＞0.05），与单独佐剂组相比显著升高（P＜0.01），但IL-4水平各组差异不显著（P＞0.05）[15]。

8 口蹄疫防控

口蹄疫病毒（FMDV）经消化道、呼吸道进入动物机体，首先在咽喉部和扁桃体增殖，随后进入血液循环系统，因此黏膜免疫对预防口蹄疫具有重要意义。王潇等分别构建了含FMDV VP1基因及小鼠IL-10基因的重组核表达质粒pcD-VP1和proVAX-IL-10，将两种重组质粒同时或pcD-VP1单独免疫小鼠，检测免疫效果，结果显示，与单独接种pcD-VP1相比，加入IL-10分子佐剂后可诱导更高水平的黏膜sIgA的表达及分泌，极大地提高了黏膜部位抗原特异性T细胞增殖反应及CD4+T细胞中IL-4的表达量[16]。张馨玉等将经壳聚糖包裹的口蹄疫核酸疫苗pcD-VP1制备成的纳米颗粒，将纳米颗粒和核酸疫苗同时分别经4种不同黏膜途径如口服、滴鼻、直肠和生殖道等免疫小鼠，检测免疫效果，纳米颗粒滴鼻和直肠免疫组，纳米颗粒较单独核酸疫苗组产生抗体的高峰提前2周，但口服和生殖道免疫组，纳米颗粒较单独核酸疫苗组产生抗体水平并没有提高，但生殖道和直肠免疫组，纳米颗粒较单独核酸疫苗组产生良好的细胞免疫应答反应[17]。

9 猪流感防控

猪流感病毒（SIV）主要经呼吸道黏膜途径感染猪，因此，局部黏膜免疫力的提升，可阻止SIV对猪的感染。师小潇等选择SIV血凝素（HA）的T、B抗原表位，将多个表位片段串联，克隆到原核表达载体pET-30a（+）中，对串联表达的重组SIV蛋白SIV-ep1、SW-ep2、SIV-el2，经灌胃途径免疫6周龄昆明小鼠，检测免疫小鼠抗体及细胞免疫水平，结果发现，3免后各免疫组血清IgG抗体及黏膜sIgA抗体与对照组相比有着非常显著的差异（P＜0.01），细胞免疫检测显示，所有免疫组小鼠外周血T淋巴细胞增殖明显，SIV血凝抗体检测结果显示，SIV-ep1免疫组、SIV-ep2免疫组、SIVep1与LT蛋白免疫组抗SIV H1N1亚型HI效价达1∶1 024，SIV-el2蛋白免疫组HI效价达1∶512[18]。

10 小结

黏膜对主要经黏膜途径入侵猪的病原体有较好的防控作用，与常规免疫相比，经黏膜途径免疫操作简便，省时省力，对猪应激及副作用小，能发挥占位效应，避免了潜伏期疾病的的人工接种感染，适合规模化养殖场应用。黏膜免疫不仅能形成局部免疫应答，还能诱导全身性细胞、体液和黏膜免疫应答反应，是未来猪用疫苗很有前景的一种免疫方式。为提高黏膜免疫效果，还要进行佐剂的筛选、免疫的途径、抗原活性的最大保持及有效的利用等方面的研究。目前已有专家从猪体内分离出肠道定植的益生菌作为疫苗的载体，制备成可口服的疫苗，能使疫苗的效力达到最佳。随着技术不断发展，未来黏膜免疫一定会成为猪场的主流免疫方式。