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浅析血凝抑制试验操作注意事项

2019-02-12黄春华

兽医导刊 2019年14期
关键词:血凝效价注意事项

崔 旭 黄春华

(1.重庆市石柱县下路街道畜牧兽医站,重庆 409100;2.重庆市石柱县动物疫病预防控制站,重庆 409100)

血凝素(HA)的病毒能凝集人或动物红细胞,称为血凝现象,血凝现象能被相应抗体抑制称为血凝抑制试验,一种测定抗原或抗体的技术。即加入特异性抗体或特异性抗原后,使原有的血凝反应被抑制,动物疫病方面主要用于H5亚型与H7亚型禽流感、新城疫等疫病的免疫抗体滴度测定,为免疫程序的制定提供技术支撑。为现行的家禽调运监管政策,H7亚型禽流感监测报告出省有效期为21天提供指导依据。此法简称“75μl”法,虽然看似简单,但在阿氏液、PBS液、1%红细胞制备、抗原验证、4倍病毒抗原回归试验等方面仍存在许多注意事项,只有做好操作过程中的每个细节,方能最大限度减少误差,确保结果的准确性。现将试验过程中注意事项简单分析以下:

1 实验前的工作准备注意事项:

(1)房间温度应恒温控制在20~25℃,温度过高或者过低都会影响实验反应时间,所以整个实验过程应控制在一个恒定的温度下完成。

(2)工作台在实验进行前和实验结束后都要彻底消毒,以免造成污染,建议用75%酒精均匀的喷洒工作台反复三遍。

(3)样品与试剂均应提前20min从冰箱取出恢复至常温后,方可进行实验。

2 材料的准备注意事项

(1)96孔微量反应板的选择,在选择反应板的时候一定要仔细观察是V型还是U型,本实验应该选着V型反应板,当不便观察的时候可以用手触摸孔底有尖尖的刺感来判断是V型还是U型。

(2)PBS液、阿氏液和1%红细胞的制备:阿氏液和PBS液配制过程中应注意酸碱度的调整,阿氏液pH值应调整在6.1,PBS液pH值应该在7.2,配置好的阿氏液和PBS 液经高压灭菌后方可使用,或者4℃保存,但保存时间不宜过长,一般不超过21d。1%红细胞配制过程中,在选择公鸡时一定要选择无特定病原(SPF)公鸡3~5只。在洗涤红细胞离心机转速保持在1500转左右约3~5min,转速过快会造成红细胞破裂造成溶血。洗涤次数保持在4~8次之间,实际操作过程中以离心后的上清液与PBS液保持同等清晰度时为准,备用。

3 实验过程中注意事项

(1)病毒抗原效价的测定,每次试验前均应检测病毒抗原效价,因为病毒抗原效价一经使用会随着使用次数逐渐降低,在恒温状态下应充分保证静置反应时间在40min后以最后1孔完全凝集状态读取结果。

(2)倍病毒抗原液的配制及验证,此项是本实验操作的关建,以病毒抗原log2效价除以4作为抗原稀释倍数,例如抗原效价为log10,则稀释倍数为256,验证配制好的4倍抗原液以前2孔完全凝集状态,第3孔为半凝集状态(出现点状红细胞沉集,泪流状态不明显),第4孔红细胞成纽扣状沉于孔底,红细胞完全沉集泪流状态明显下流。若回归试验未成立,则需重新测定抗原效价、配备4倍抗原再次回归试验直至成立,以最佳状态的稀释倍数抗原备用。

(3)样品稀释,将恢复常温的样品加入到凝集板中,加样时枪头应悬空,并一次性排出样品,做明样品和阴阳性对照标记。倍比稀释过程中,避免枪头松动吸入空气,产生气泡,移液器每孔吸放次数在10次左右,稀释至第10孔结束,若操作过程倍比稀释不好,会产生跳孔现象。

(4)结果判定,在红细胞加入后静置40min后方可读取结果,实际操作过程中可以参照对照红细胞孔将呈明显的纽扣状沉于孔底、对照病毒抗原孔出现完全凝集时,可读取结果,读取结果时应将反应板作45°倾斜,背面垫A4纸作为底色,以完全抑制红细胞凝集的最大稀释倍数判为该血清的血凝抑制滴度。读取结果应在10min之内完成,时间过久会导致反应时间过长,误判效价。

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