刘小勤 杨艳

(西南医科大学心血管医学研究所医学电生理学教育部和四川省重点实验室、四川省心血管疾病防治协同创新中心，四川 泸州 646000)

血管张力调节是收缩与舒张的动态平衡，血管收缩主要通过肌球蛋白轻链激酶(Myosin lightchain kinase，MLCK)调节肌球蛋白轻链磷酸化实现，血管舒张主要通过肌球蛋白轻链磷酸酶(Myosin light chain phosphatase，MLCP)使肌球蛋白调节轻链(Myosin regulatory light chains，RLC)去磷酸化实现。MLCP是调节血管信号的关键分子。MLCP是异源三聚体蛋白磷酸酶，由肌球蛋白靶向亚基(Myosin phosphatase targeting subunit，MYPT)、38kDa催化亚基(Catalytic subunit of protein phosphatase type 1，PP1cδ)和功能未知的21kDa小亚基组成[1]。MLCP作为ROCK(Rho-associated protein kinase，ROCK)和NO/cGMP/PKG(Nitric oxide，NO；cGMP-dependent protein kinase，PKG)途径的下游靶标，其活性决定肌球蛋白调节轻链磷酸化状态以调节血管张力。现就MYPT1在调节血管张力中的研究进行阐述。

1 肌球蛋白磷酸酶靶向亚基结构

肌球蛋白磷酸酶靶向亚基是Hubbard和Cohen在1993年发明。MYPT有MYPT1、MYPT2、MYPT3、85kDa蛋白磷酸I肌球蛋白结合亚基(Protein phosphatase 1 myosin binding-subunit of 85 kDa，MBS85)和TGF-β1抑制的膜相关蛋白(TGF-β1-inhibited，membrane-associated protein，TIMAP)。MYPT1由1032个氨基酸组成，靠近N末端有一个RVxF基序(结合催化亚基PP1cδ位点)和几个锚蛋白重复序列，中心区域是酸性和丝氨酸/苏氨酸结构域，靠近C端是亮氨酸拉链(Leucine zipper，LZ)可变剪接结构域[3]。MYPT1家族主要中心(Central insert，CI)外显子及LZ外显子可变剪接[1]，可表达8种亚型[4]；MYPT1也具有多个可磷酸化位点。目前研究集中于亮氨酸拉链可变剪接和丝氨酸/苏氨酸结构域与血管张力调节作用。

2 MYPT1亚型与相关生理病理状态

2.1 MYPT1亚型

哺乳动物的CI外显子亚型转换相对保守。虽然特异性外显子可变剪接保守，但几乎所有物种MYPT1的CI外显子能产生可变剪接[5]，但该区域可变剪接功能尚不明确。对不同物种的MLCP组成进行克隆和测序，确定MYPT1亚型[3,6]。近些年，主要研究MYPT1转录子LZ可变剪接。其剪接包含外显子24(Exon 24，E24；鸟类的外显子23，E23)，改变MYPT1转录子阅读框架并引入一个提前终止密码子，导致C末端缺乏LZ结构。反之，则含有LZ结构。

2.2 MYPT1亚型相关的生理病理状态

在发育和疾病状态下，MYPT1亚型转换与血管张力调节相关，影响血管收缩和NO/cGMP介导的血管舒张。研究发现，在生长的发育期和成年期，平滑肌表现慢时相收缩表型，表达MYPT1-E24/LZ+亚型。之后表现快时相收缩表型，表达MYPT1-E24/LZ-亚型。De Mey等建立二级肠系膜动脉(Second-order mesenteric artery，MA2)结扎的“高血流(High flow，HF)/低血流(Low flow，LF)”模型[7]，发现HF和LF-MA1恢复MYPT1-E24-/LZ+亚型，但LF-MA1恢复持久[8]。8-bromoguanosine 3,5′-cyclic-monophosphate(8-Br-cGMP，cGMP激动剂)引起LF-MA1更大舒张。John[9]等诱导小鼠平滑肌条件性敲除E24。单个E24等位基因(转换为MYPT1-LZ+)可增强收缩MA1对diethylamine-NONOate(DEA/NO)和cGMP介导的血管舒张。两个E24等位基因敲除没有加强血管转换为MYPT1-E24-/LZ+亚型。MA对MYPT1亚型移位具有高度敏感性。门静脉高压[15]和妊娠高血压[10]血管MYPT1亚型有类似变化。在大鼠心肌梗死和充血性心力衰竭中主动脉和髂动脉MYPT1-LZ+亚型减少[11]。肺动脉高压大鼠肺动脉MYPT1-LZ+表达上调，但总MYPT1量不变[12]。猪冠状动脉狭宰且不运动会改变心外膜动脉(E24-/LZ+)和阻力小动脉(E24+/LZ-)MYPT1亚型[13]。在妊娠及分娩时，人子宫平滑肌MYPT1亚型表达发生变化[14]。总之，MYPT1亚型转换影响NO/cGMP/PKG通路介导舒张效应。

3 MYPT1磷酸化位点与血管张力调节及相关生理病理状态

3.1 MYPT1磷酸化位点与血管张力调节

MYPT1有近130个磷酸化位点参与其磷酸化[15-19]。MYPT1能增强PP1cδ与肌球蛋白结合的催化活性和特异性[20]。调节PP1cδ对RLC活性的MYPT1上多个磷酸化位点是调节收缩或舒张效应的调节点[21]。与调节血管张力有关的MYPT1磷酸化位点主要有：T697、T855、S696、S854、S669。ROCK磷酸化MYPT1-T697和T855位点[22]，磷酸化苏氨酸位点结合至PP1cδ，抑制PP1cδ接近LC20底物以减弱MLCP活性[28]。在血管主动脉平滑肌细胞中，血管紧张素II，内皮素-1或(5Z)-7-[(1R,4S,5S,6R)-6-[(1E,3S)-3-Hydroxy-1-octenyl]-2-oxabicyclo[2.2.1]hept-5-yl]-5-heptenoic acid(U46619)明显增加MYPT1-T696磷酸化水平[23]。MYPT1-T697/T855磷酸化与血管平滑肌收缩有关。S696和S854可被cAMP依赖性蛋白激酶(cAMP-dependent protein kinase，PKA)和PKG磷酸化[24]，作用于MLCP以引起舒张反应。ROCK相关位点磷酸化阻止PKA磷酸化S696和S854[25,26]，抑制MLCP活性以引起收缩反应。S669磷酸化速度比S696更快并且在MYPT1-S696处预磷酸化可以增强S669磷酸化率。S669磷酸化与NO/cGMP引起舒张效应有关，8-Br-cGMP处理的大鼠脑动脉pS696-MYPT1水平没有增加[27]。Nakamura等[28]用cGMP刺激股动脉，其S696磷酸化增加，但双磷酸化的pS696pT697-MYPT1没有变化。S668是PKG作用MYPT1的新颖位点，PKG必须存在MYPT1-LZ结构域，使MYPT1-S668磷酸化并激活MLCP[29]。MYPT1通过与PP1c直接相互作用，或作用不同激酶磷酸化及可能影响RLC磷酸化蛋白质支架，在调节MLCP活性中发挥重要作用[1,30]。未来可将Phos-tag-SDS-PAGE蛋白质印迹与已验证磷酸化特异性抗体结合，进一步研究PKG与MYPT1磷酸化位点如何整合以控制平滑肌中MLCP活性。

3.2 MYPT1磷酸化位点与生理病理状态

老年杂合子MYPT1-T696A/+敲除小鼠基底动脉增加MLC20-S19和MYPT1-T853基础磷酸化以抑制MLCP活性，具更高血管收缩反应性[31]。大鼠尾动脉遇冷，MYPT1-T855磷酸化增加[32]。雄性小鼠脑动脉收缩调节与MYPT1-T696、S695/S668磷酸化有关[33]。麻醉药氟醚和异氟醚舒张KCl引起大鼠主动脉收缩，抑制MYPT1-T853磷酸化，不影响MYPT1-T696；舒张Ang II诱导大鼠主动脉收缩，抑制MLC和MYPT1-T853磷酸化[34]。DEA/NO抑制猪冠状动脉MYPT1-T853磷酸化，直径较大冠状动脉对硝基类血管扩张剂响应更强，部分原因是PKG1和MYPT1活性增加[35]。糖尿病小鼠股动脉超收缩反应与MYPT1-T696/T853位点磷酸化增加有关，与MYPT1-S695位点磷酸化无关[36]。高原缺氧母羊肺动脉ROCK活性增加，即增加MYPT1-T696和T850磷酸化来抑制PKG作用[37]。在T696和T853(人序列)上的p-MRLC和p-MYPT1水平与张力水平一致[38]。

4 MYPT1亚型及MYPT1磷酸化位点与NO/cGMP/PKG

MYPT1-LZ+/-与NO/cGMP/PKG途径介导血管舒张有关。当缺乏LZ时，PKG会直接结合MYPT1-LZ-[39]。当表达LZ时，NO下游的cGMP、PKG和MLCP活性增加，这需要PKG1α磷酸化MYPT1。这可能要形成MYPT1-LZ+/PKG复合物，改变MYPT1构象，影响MLCP活性。Huang QQ等证实MYPT1-LZ+是结合PKG1α-LZ和cGMP使MLCP活化必需的结构域[40]。MYPT1-LZ+表达降低的平滑肌细胞对NO敏感性降低[41]。研究证实MYPT1-LZ+对cGMP介导MLC20去磷酸化敏感性更强，使动脉松弛[9,42]。MYPT1亚型可能改变NO/cGMP介导血管舒张的敏感性。本课题组研究雄性成年自发性高血压大鼠(Spontaneously hypertensive rats，SHR)和成年对照Wistar-Kyoto(WKY)大鼠，高血压老年大鼠(SHR-old)和WKY老年大鼠(WKY-old)三级肠系膜动脉对NO供体硝普钠(Sodium nitroprusside，SNP)的敏感性，在SNP浓度为10nM时，成年对照WKY大鼠三级肠系膜动脉对SNP的敏感性比其他三组动物高，但这是否与MYPT1亚型转换有关，将进行进一步探索。

NO/cGMP/PKG1α途径激活MLCP在平滑肌舒张中起重要作用。PKG引起平滑肌松弛，部分原因是MLCP增加LC20去磷酸化的速率[43]。PKG催化MYPT1-S695磷酸化，S695磷酸化不是直接激活MLCP[44]，而是通过阻止相邻抑制性T696[24]磷酸化或通过激活使pMYPT1-T696去磷酸化的未知磷酸酶来激活MLCP。MYPT1-S695/T696磷酸化之间的拮抗作用促进MLCP抑制状态的降低[24]。PKG对MYPT1磷酸化是由PKG与MYPT1-LZ+作用介导的[42]。MYPT1-LZ+是PKG1α高亲和力底物。MYPT1亚型和磷酸化位点对于确定血管床对硝基异质反应是重要的，在健康和疾病下调节血管张力中起重要作用[45]。本课题组发现成年SHR、SHR-old、WKY-old与WKY大鼠相比，WKY大鼠MA3对SNP敏感性更强，机制研究发现成年SHR、SHR-old和WKY-old的MA3的可溶性环化酶1α、可溶性环化酶1β和PKG1α蛋白表达发生改变，MYPT1磷酸化位点情况将进一步研究。

5 展望

MYPT1是一种潜在的重要血管疾病治疗靶点，已有研究表明MYPT1与疾病的相关性。MYPT1亚型转换和MYPT1磷酸化条件多种多样。由于难以确定作用特异性，靶向MYPT1以用于调节MLCP活性和平滑肌收缩尚未取得较大研究进展。MYPT1可变剪接结构可能具有较大潜力。MYPT1亚型转换和磷酸化位点与血管张力作用需要继续探索，靶向位点特异性MYPT1磷酸化的特异性分子值得进一步研究，这些工作将为治疗心血管疾病探求到新靶点。