曲范杰 张捷 时淑珍

[摘要]目的 探讨比卡鲁胺对人三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的影响及其可能的机制。方法 0、25、50、100 μmol/L比卡鲁胺处理人三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞，MTT法检测细胞的抑制率;流式细胞仪检测比卡鲁胺对MDA-MB-231细胞作用后凋亡率及其细胞周期分布的影响。结果 不同浓度（25、50、100 μmol/L）比卡鲁胺处理后，MDA-MB-231细胞增殖能力明显下降，且存在时间、剂量依赖关系。比卡鲁胺可以明显地增加细胞凋亡，细胞周期表现为G0/G1期阻滞（P<0.05）。结论 比卡鲁胺可能通过诱导细胞凋亡及抑制细胞周期的机制从而对人三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖产生抑制作用。

[关键词]三阴性乳腺癌;比卡鲁胺;MDA-MB-231;细胞增殖;细胞凋亡

[中图分类号] R737.9          [文献标识码] A          [文章编号] 1674-4721（2019）12（c）-0047-03

Effect of Bicalutamide on proliferation inhibition and induction apoptosis in triple negative breast cancer MDA-MB-231 cells

QU Fan-jie1   ZHANG Jie1   SHI Shu-zhen1   YUAN Xiao-lin2

1. Department of Oncology， the Third People′s Hospital of Dalian， Liaoning Province， Dalian   116033， China; 2. Central Laboratory， Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian University， Liaoning Province， Dalian   116001， China

[Abstract] Objective To explore the effect of Bicalutamide on the proliferation of human triple negative breast cancer MDA-MB-231 cells and its potential molecular mechanism. Methods The human triple negative breast cancer MDA-MB-231 cells were treated with 0， 25， 50， 100 μmol/L Bicalutamide， MTT method was used to detect the inhibition rate of cells， and flow cytometry was performed to assay the effect of Bicalutamide on the apoptosis rate and cell cycle distribution of MDA-MB-231 cells. Results After treatment with different concentrations （25， 50， 100 μmol/L） of Bicalutamide， the proliferation ability of MDA-MB-231 cells significantly reduced， and there was a time-and dose-dependent relationship. Bicalutamide could significantly increase apoptosis of the MDA-MB-231 cells and induced the cycle arrest at G0/G1 phase （P<0.05）. Conclusion Bicalutamide can inhibit the proliferation of human triple negative breast cancer cells and potential molecular mechanism refers to cell apoptosis.

[Key words] Triple negative breast cancer; Bicalutamide; MDA-MB-231; Cell proliferation; Cell apoptosis

三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）是一组具有特殊的生物学行为和临床病理学特征的乳腺癌[1]，其特征是组织学分级高，侵袭性强，预后较其他亚型的乳腺癌差，缺乏相应的靶向治疗[2]。TNBC的治疗是目前临床亟待解决的问题。为评价雄激素抑制剂比卡鲁胺（Bicalutamide）用于TNBC临床治疗的可能性及可行性，本研究采用体外研究的方法探讨了Bicalutamide对TNBC细胞增殖及细胞凋亡的影响，现报道如下。

1材料与方法

1.1材料

人TNBC细胞株MDA-MB-231细胞、碘化丙啶（PI）由大连大学附属中山医院中心实验室提供;胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自杭州四季青公司;DMEM培养基为Gibco公司产品;胰蛋白酶、二甲基亚砜（DMSO）、磷酸盐缓冲液（PBS）、四甲基偶氮唑蓝（MTT ）试剂盒为美国Sigma公司产品;比卡鲁胺购自阿斯利康公司;Annexin-V/PI双染凋亡试剂盒为江苏凯基公司产品;流式细胞仪（BD Flow cytometers & Reagents）为美国BD公司产品。

1.2细胞培养

采用含10%灭活FBS、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素的DMEM培养基，并严格要求在37℃、CO2体积分数为5%的饱和湿度环境下进行细胞培养。当MDA-MB-231细胞生长呈70%～80%融合状态时，再以0.25%胰蛋白酶进行消化传代。以上细胞生长情况均在倒置显微镜下观察，取对数生长期的细胞进行实验。

1.3实验分组

实验分为溶剂对照组和药物干预组。比卡鲁胺先由DMSO溶解并配成100 mmol/L 储存液，-20℃避光保存。再以DMEM培养基将比卡鲁胺储存液稀释到所需的浓度，使其中DMSO终浓度<0.1%。溶剂对照组即终浓度0.1%的DMSO，药物干预组即比卡鲁胺终浓度分别为25、50、100 μmol/L。

1.4细胞增殖抑制率的检测

于96孔板中接种处于对数生长期的MDA-MB-231细胞，调细胞为4×103孵育12 h后加入不同浓度比卡鲁胺（0、25、50、100 μmol/L），每组6个复孔。分别于0、24、48、72 h采用MTT法，按照说明书操作检测细胞活力，于酶标仪上测定各孔570 nm处吸光度（OD）值。每48 h更换培养液。

细胞增殖抑制率（%）=（1-实验组平均OD值）/对照组平均OD值×100%。

1.5流式细胞仪检测细胞周期分布情况及细胞凋亡情况

分别采用不同浓度的比卡鲁胺（25、50、100 μmol/L）作用于MDA-MB-231细胞48 h，应用流式细胞仪检测其诱导凋亡情况及细胞周期分布情况。于6 孔板中接种对数生长期的MDA-MB-231细胞，调细胞为4×103，待细胞贴壁后分别加入0、25、50、100 μmol/L 的比卡鲁胺，继续培养48 h，收集各孔的培养液到对应的流式管中，1000 r/min离心10 min收集细胞，冷PBS清洗2次，再次收集到对应的流式管中，加入70%冰乙醇-20℃避光过夜。次日，再次离心并去乙醇，以预冷PBS洗涤后用含有终浓度20 mg/ml RNaseA酶的PI染液避光染色20 min，上流式细胞仪检测。采用Multicycle System对细胞周期进行分析。每组重复3次。

1.6统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，两组以上数据比较用方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1比卡鲁胺对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的影响

25、50、100 μmol/L比卡鲁胺处理MDA-MB-231细胞24 h细胞增殖抑制率分别为（29.45±1.23）、（32.38±1.93）、（45.31±4.23）%，与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）;干预48 h细胞增殖抑制率分别为（39.33±1.23）、（45.33±2.43）、（62.31±5.23）%，与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）;干预72 h细胞增殖抑制率分别为（46.13±2.63）、（53.93±3.13）、（74.31±5.28）%，与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。相同浓度组随着时间的延长细胞增值抑制率显著提高（图1）。提示比卡鲁胺对TNBC细胞的生长有抑制作用，其抑制作用随着药物浓度的增加和作用时间的延长逐渐增强，且明显与时间、剂量有关。

2.2比卡鲁胺对MDA-MB-231细胞凋亡及细胞周期的影响

随着比卡鲁胺浓度的增加，MDA-MB-231的细胞凋亡率明显增加，与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.01）;比卡鲁胺25、50、100 μmol/L各组的的细胞凋亡率比較，差异有统计学意义（P<0.05），即随着比卡鲁胺浓度的增加，高浓度组较低浓度组细胞凋亡比例明显增加。比卡鲁胺作用48 h后，G0/G1期细胞比例升高，S期比例降低，与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）;G2/M期细胞比例较对照组有升高趋势，但差异无统计学意义（表1）。

3讨论

有研究发现，雄激素受体（AR）与TNBC的发生、发展、复发和转移以及预后有关，提示AR信号通路在TNBC的发生发展中具有重要作用[3-8]。已经有更多的研究者注意到，雄激素及其受体信号通路是乳腺癌，尤其为HR-AR+亚型乳腺癌患者可能的治疗靶点[9-12];通过抑制AR通路可能对TNBC治疗有效。雄激素及其受体信号通路在前列腺癌的发生发展中承担重要作用，比卡鲁胺通过抑制AR的途径被应用于前列腺的临床治疗也取得了满意的疗效。近年来开展的临床研究也发现，TNBC应用AR抑制剂比卡鲁胺等治疗也可以获得良好的临床受益[13-17]。恶性增殖是肿瘤细胞的重要特征，为进一步评价雄激素抑制剂比卡鲁胺用于TNBC的临床治疗的可能性及可行性，及探索其可能的机制，本研究采用体外研究的方法，应用TNBC细胞株，观察比卡鲁胺对TNBC MDA-MB-231细胞增殖的影响。

本研究结果显示，比卡鲁胺对TNBC细胞的增殖有抑制作用。应用不同浓度的比卡鲁胺作用MDA-MB-231细胞24～72 h后，均可观察到MDA-MB-231细胞的生长受到明显抑制，其抑制作用随着比卡鲁胺浓度的增加和作用时间的延长而逐渐增强，且明显呈时间-剂量依赖关系。

细胞增殖的抑制作用往往与细胞周期密不可分，目前，细胞周期阻滞的机制越来越受到研究者的关注，干预及调节肿瘤细胞的细胞周期从而阻滞细胞生长是目前肿瘤治疗的重要策略。在细胞周期中，S期是DNA合成期，因此S期细胞比例下降常表明细胞的DNA合成下降，细胞的增殖受抑制。本研究采用不同浓度的比卡鲁胺（25、50、100 μmol/L）作用于MDA-MB-231细胞48 h，应用流式细胞仪检测其诱导凋亡情况及细胞周期分布情况，结果显示，比卡鲁胺作用后的MDA-MB-231细胞凋亡比例明显增加，与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.01）;比卡鲁胺25、50、100 μmol/L各组的细胞凋亡率比较，差异有统计学意义（P<0.05），提示比卡鲁胺诱导MDA-MB-231细胞凋亡呈浓度依赖关系。同时本研究结果显示，比卡鲁胺作用48 h后，G0/G1期的细胞比例升高，S期的细胞比例降低，与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）;G2/M期细胞无明显变化。提示比卡鲁胺阻滞了TNBC细胞由G0/G1期向S期的转化，并抑制DNA的合成，从而干预了MDA-MB-231细胞的细胞周期分布，最终抑制了MDA-MB-231细胞的增殖。

综上所述，比卡鲁胺明显抑制TNBC MDA-MB-231细胞的增殖，可能通过诱导MDA-MB-231细胞凋亡发挥直接抗肿瘤作用，比卡鲁胺对MDA-MB-231细胞周期的调节是其抑制肿瘤细胞增殖的机制之一，这为比卡鲁胺在TNBC的临床应用提供了更充分的实验依据。

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（收稿日期：2019-06-14  本文編辑：任秀兰）