王继锋 段莉 李耀玺 王大平

[关键字]外泌体；骨性关节炎；间充质干细胞

随着人口的老龄化，骨性关节炎（osteoarthritis,OA）已经成为致残的重要原因之一，且发病率逐年上升，被称为不治之症。OA 的发病机制十分复杂，正常人的关节软骨属于透明软骨，软骨细胞占关节软骨体积的1%～5%，其可分泌Ⅱ型胶原、透明质酸等成分，维持细胞外基质的代谢平衡。当年龄增大时，关节软骨发生退行性纤维病变，弹性降低，生理结构发生改变，软骨细胞发生过度增殖及肥大化，最终导致不能正常合成聚氨基葡萄糖及透明质酸，从而导致软骨降解及基质的丢失[1]。外泌体是一种由细胞分泌的微囊泡，其在人体中的细胞或系统之间的交流、调节人体内环境稳态及对一些疾病的影响起到重要作用。最新研究表明，不同细胞来源的的外泌体在骨性关节炎疾病的发生、发展中起到十分重要的作用。本文就外泌体在骨性关节炎治疗的研究进展做一综述。

1 外泌体概述

1.1 外泌体的概念

外泌体（exosome，EXOs）是一种由细胞分泌的，直径为30～150 nm 的具有磷脂双分子层结构的膜性扁平杯碟状的微囊小泡，其包含核酸、蛋白质等多种生物活性物质。最初人们认为这些囊泡状物质是细胞排泄的废物，但随着科学研究的不断深入，人们发现这些微囊泡在生物体细胞及系统间的通迅交流中起到极其重要的作用[2]。与传统信息信号途径相比，EXOs 是一种细胞之间更高等级的交流方式，其作为载体可将miRNA、mRNA 及蛋白质等多种大分子或小分子运送到靶细胞中，从而参与人体细胞或系统间的调控作用[3]。

1.2 外泌体的分离

EXOs 是通过多泡体与质膜或浆膜融合形成的，直径为30～150 nm，而微囊泡的形成则是从质膜上脱落，直径为100～1 000nm。2009 年，布鲁诺等将MSC 的分泌物对甘油所致的急性肾损伤的改善作用归因于微囊泡（80 nm 到1 m之间）的作用。而相比较之下，Lai 等[4]认为这是外泌体起到了保护的作用。这是一种内源性的囊泡，并具有外源性的相关蛋白，如Alix、TGS101 及CD9、CD63 和CD81 等。由于研究EXOs的功能结构需要排除病毒或其他杂质蛋白的影响，故如何能最大化地除去杂质来保证分离出外泌体的纯度成为关键。而不同的EXOs 提取方法所获得EXOs 无论从纯度还是从粒子的完整性方面差异均较大。目前，EXOs 的提纯分离方法主要分为以下几种:蔗糖密度梯度离心法;差速超速离心法;化学沉淀法;凝胶过滤法;免疫亲和法。Labb 等[5]认为，使用化学沉淀法来提取EXOs 虽然可以获得大量颗粒，但纯度不够，即所得产物中虽然有大量蛋白质，但都不属于EXOs。而超速离心法可以很好地达到纯度要求，但由于转速过快导致易破坏EXOs 表面囊泡状膜结构。此外一些研究表明，可利用免疫亲和法来获取EXOs。抗体通过共价键或高亲和力与磁珠相互作用，通过低速离心或磁性技术来进行物理分离。Sharma 等[6]开发出了一种新的基于免疫亲和的方法来从患者血浆中的正常细胞分泌的EXOs 中分离黑色素瘤细胞分泌的EXOs（MTEX）。

1.3 外泌体的鉴定

2 外泌体在骨性关节炎中的应用研究进展

2.1 外泌体在骨性关节炎诊断中的研究进展

炎症是OA 滑膜炎导致骨和软骨破坏的进展过程的关键因素之一。炎症过程所产生的一系列促炎细胞因子、趋化因子及一些基因的表达在OA 的发病机制中起到了特殊作用[8]。Domenis 等的研究表明，滑膜液（synovial fluid,SF）来源的外泌体可以刺激外周血单核细胞分化的炎性M1巨噬细胞分泌IL-1 和IL-16[9]，而IL-1 在OA 发病机制中的关键作用已被广泛认识，IL-1 在OA 滑膜液中的水平显著升高，这可使其在OA 诊断中起到生物标记物的作用[10]。而且，IL-1 在参与OA 发病机制中的细胞级联反应中的上游发挥作用，其可诱导其他几种促炎反应因子（如IL-6 和IL-8）的表达和释放，以及基质金属蛋白酶的合成。在这项研究中，Domenis 等还发现SF 分泌的外泌体能刺激M1 型巨噬细胞产生CCL-20、CCL-15 和CXCL1 等趋化因子。CCL-20 能通过诱导相关分解基因的表达和改变软骨细胞表型来发挥作用，其刺激MMP-13、ADAMTS-5 和COL-X 型mRNA 的表达，同时抑制新鲜的体外培养的软骨组织中COLⅡ型mRNA 的表达[11]；而CXCL1 在OA 软骨细胞中表达上调[10]，其可诱导软骨细胞肥大和凋亡。SF 分泌的外泌体还能刺激M1 巨噬细胞释放MMP7 和MMP12。这两种蛋白酶据研究发现与OA 严重程度密切相关[12-13]。MMPs 是导致软骨降解的主要酶，而软骨细胞外基质的降解是OA 的最本质的特征。以上研究说明，外泌体作用于细胞后产生的相关细胞因子可以为诊断骨性关节炎提供一个新思路。

2.2 外泌体在治疗骨性关节炎中的研究

目前，对于人胚胎干细胞诱导的间充质干细胞（ESCMSCs）来源的EXOs 对骨性关节炎的防治作用机制研究颇为深入。Wang 等[14]发现，向C57 小鼠关节腔里注射ESCMSCs 可以减轻DMM 模型中的软骨破坏和细胞外基质的降解。这种作用最终被确定为是ESC-MSCs 分泌的EXOs 发挥的作用。在IL-1 的存在下，EXOs 通过增加Ⅱ型胶原的合成以及提高ADAMTS5 的表达来维持软骨细胞的表型，即ESC-MSCs可以通过EXOs来平衡软骨细胞外基质的合成和降解，达到治疗OA 的作用，这为OA 的防治以及药物开发提供了一个崭新的思路。有体外实验证明，在具有免疫活性的大鼠软骨缺损模型中，人间充质干细胞分泌的EXOs 可促进其软骨再生[15]。结果 显示，MSCs-EXOs 可加速软骨组织的填充以及增强了Ⅱ型胶原蛋白和硫酸糖胺聚糖等基质的合成。EXOs 处理过的大鼠软骨和软骨下骨完全修复，表面规则，具有透明软骨的特征。这种透明软骨可以与周围的正常软骨相紧密结合，浑然一体，并观察到有大量的细胞外基质沉积。

2.3 外泌体与骨性关节炎的微环境

有研究表明，低氧是骨性关节炎形成的一个重要因素。其中，低氧诱导因子1（HIF-1 ）通过激活低氧反应元件被认为是细胞适应低氧和分解应激的关键调节因子[16]。通过诱导相关合成因子和抑制一些关键的分解因子来维持和调节软骨紊态。例如，HIF-1 可促进COX-2、CXCL-2 及IL-1、IL-6 的合成，从而引发骨性关节炎微环境中的炎症反应，HIF-1 通过NF-/HIF-1 信号通路上调MMP2 和MMP9 的表达。这也说明关节液和软骨组织中的HIF-1 在OA 的发病机制中起到了重要作用。有研究表明，在TNF-诱导的软骨细胞凋亡中，HIF-1 修饰的骨髓间充质干细胞来源的外泌体（BMSC-EXOs）对关节软骨损伤具有修复作用，其可抑制炎症环境中软骨细胞的凋亡[17]。

上述骨性关节炎微环境的变化也与软骨细胞分泌的EXOs 载有的一些蛋白质和微小RNA 有关[18]。MiRNA 是一种单链的非编码的小分子，长度为20 个核苷酸左右，其可影响OA 的炎症反应过程，MSCs-EXOs 中含有大量的miRNA，这在MSCs-EXOs 治疗外泌体中发挥着重要作用，如miR-92a 可通过增强软骨细胞增殖、诱导软骨形成而达到治疗OA 的目的[19]。MiR-320 则可以增加软骨细胞ECM 合成并下调负性调节因子（如MMP-13 和ADAMTS-4）的表达来减轻OA 的发生[20]。

最近有研究发现，miR-146 加重了促炎症细胞因子的表达，同时抑制了软骨基质相关基因的表达，其通过下调TNF-/ 途径来参与OA 进程。动物实验证明，用miR-146 抑制剂治疗的经手术诱导的OA小鼠，通过靶向Camk2d和Ppp3r2显著减轻了关节软骨的破坏。有研究表明，由软骨细胞分泌的外泌体中所表达的Wnt5a 和Wnt5b 通过选择性的Wnt 信号通路激活了Yes 相关蛋白（Yes-associated protein，YAP），增强了软骨细胞的增殖和转移，但却降低了软骨细胞ECM的分泌。实验证实，SMSC-140-EXOs 增强了ACs 的增殖和迁移，却没有降低ECM 的体外分泌的缺点。体内实验进一步证实，SMSC-140-EXOs 可以成功阻止大鼠OA 模型疾病的发生[21]。这些miRNA 既存在于EXOs 中，同时也参与了MSCs 抑制OA 的炎症反应。这是促进关节软骨修复改善OA的潜在策略[22]。

2.4 不同细胞来源的外泌体对骨性关节炎的影响

关节滑膜炎症和血管生成是OA 发病的重要因素。有实验表明，用在IL-1 刺激下的人滑膜成纤维细胞（synovial fibroblasts，SFB）分泌的外泌体可以诱导软骨细胞OA 样基因表达模式的改变和软骨降解[23]。与没有被IL-1 刺激的SFB 相比，使用IL-1 刺激SFB 后分泌出的外泌体可以使软骨细胞中的MMP-13 和ADAMTS5 的表达显著上调，并且下调了COL2A1 和ACAN。Nanostring 分析表明，IL-1 刺激下的SFB 与未刺激的SFB 分泌的外泌体中有50 种miRNAs 的表达水平存在差异。这说明SFB 可能通过刺激关节软骨的基因表达来促进血管生成，从而参与血管生成。

Gasado 等研究发现，利用来源于骨髓间充质干细胞的外泌体（BMSC-EXOs）作用于猪的抗炎滑膜炎模型，发现其最终可以使动物模型中滑膜淋巴细胞减少，抑制T 细胞分泌TNF-。动物模型上的的动力学步态分析，如摆动时间、步长时间和姿态持续时间等参数也较之前有所改变，说明了BMSC-EXOs 在疾病中起到了免疫调节的作用[24]。

另有研究比较了诱导的多能干细胞来源的间充质干细胞（induced pluripotent stem cell-derived MSCs，iMSC）和SMMSCs 两种细胞来源的EXOs 对OA 的治疗作用效果，实验表明，注射iMSC-EXOs 和SMMSC-EXOs 都能减轻小鼠OA 模型的疾病发生，但iMSC-EXOs 的治疗效果要优于SMMSC-EXOs[25]。Gibson 等[26]证明了BMP-2 和Wnt-5a预处理的ESC 来源的EXOs 能促进大鼠软骨缺损的修复。Wang 等也进行了类似的实验，他们发现向关节内注射ESCMSCs 可减轻DMM 模型软骨破坏和基质降解。进一步的体外研究表明，这种作用是通过ESC-MSCs 分泌的EXOs 发挥作用的。EXOs 通过增加Ⅱ型胶原合成和降低ADAMTS5的表达来维持软骨细胞表型[14]。

SMMSCs 来源于滑膜，具有较高的自我更新能力，因为滑膜和关节软骨在滑膜关节发育过程中由共同的细胞群发育而来，因此SMMSCs 比其他MSCs 与软骨细胞的关系更加密切。研究显示，SMMSCs 比BMSCs 和AMSCs 更适合用于软骨修复，体外实验表明，SMMSC-EXOs 能显著促进软骨细胞的迁移和增殖[25]。但其也有缺点，在小鼠OA 模型中，SMMSC-EXOs 处理过后的软骨表面不平整，蛋白多糖丢失，浅表区的软骨消失，而用iMSC-EXOs 处理软骨时未发现上述情况。更重要的一点是，iMSCs 的获取途径可由非侵入性方法获取，而滑膜SMMSCs 的获取过程需要进行创伤性的手术。移植患者特定的iMSC-EXOs 可以避免一些伦理方面的问题和免疫抑制相关的潜在问题，并且来源广泛，取之不尽，可以满足临床需要。

3 小结与展望

目前，对于治疗OA 的EXOs 疗法还处于临床实验阶段，MSC 还没有被正式批准用于OA。但有600 多项研究已经证实使用MSC 来治疗OA 是安全的，而对MSCs-EXOs的深入研究势必会改变现有的OA 的细胞疗法，解决许多与使用活细胞作为治疗药物的有关难题，如免疫排斥反应，因为EXOs 具有最小的免疫原性和毒性[27]。而且，使用EXOs药物治疗这种方式更易被人们所接受。因为这种细胞外囊泡是人本身身体生理所具有的，它们可以通过一些非侵入性的途径，比如口服摄入、鼻腔黏膜给药，甚至可以吸入给药。EXOs 药物更适合商品化，我们可以通过基因操作来选择外泌体的来源细胞，从而生产具有无限繁殖潜力的克隆细胞系，来确保可再生的成本效益[28]。然而，在软骨修复这个方面，利用EXOs 治疗OA 仍有一些问题亟待解决，如向关节腔内注射EXOs 后对关节腔内EXOs 的分布情况和清除速率如何进行准确的评估目前尚未研究透彻，但不管怎样，EXOs 未来在治疗OA 的地位肯定会呈指数般上升。