邓慧敏， 熊英， 傅颖媛， 况南珍△

1南昌大学基础医学院(江西南昌 330006); 2江西省疾病预防控制中心疾病检验所(江西南昌 330029)

手足口病(hand foot and mouth disease, HFMD)作为一种儿童传染性病，好发生于5岁以下儿童，可引起手、足、口腔等多个部位出现疱疹，少数患儿可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜炎等并发症，病情严重时可导致患儿死亡[1]。HFMD由粪-口途径传播，柯萨奇病毒A16型(Cox A16)和肠道病毒71型(EV71)是其最为常见病原体来源[2]。与Cox A16相比，EV71具有神经毒性作用，能引起神经系统疾病和死亡，已有相关死亡病例被报道[3]。EV71是正二十面体的球形结构，由近7 500 bp的单股正链RNA基因构成，编码11个蛋白(结构蛋白VP1-4和非结构蛋白2A-C，3A-D)[4]。近几年研究已证实EV71的毒力主要与结构蛋白VP1相关，VP1的表达水平也在一定程度上代表病毒的复制能力，但至今EV71的靶点——神经毒性的抗原决定簇尚未被查证。目前，临床上也没有特效的疫苗和抗病毒药物来预防治疗EV71引起的HFMD，主要以对症治疗(免疫球蛋白静脉注射)为主，从而控制HFMD的发展和并发症[5]。天然植物中发现了许多具有抗病毒活性的有效成分，可应用于病毒感染类疾病的治疗[6-7]。金边瑞香主要包括香豆素类、木脂素类、双黄酮类三大化合物，具有抗炎[8-10]、抗氧化[11-12]、治疗糖尿病[13-14]、保护神经[15]和缺血再灌注损伤恢复[16-17]等药理作用。瑞香素(daphnetin, DAP)系香豆素类化合物，是从天然植物金边瑞香中提取的活性成分，本实验室长期从事该活性成分的研究，已经证实了瑞香素具有抗肿瘤[18]、抗炎[19]等作用，但鲜有文献报道关于瑞香素的抗病毒作用。因此，本实验室2013—2016年立足本省盛产资源，主要探讨瑞香素体外抗EV71复制的影响，为瑞香素治疗EV71感染的HFMD提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 人恶性胚胎横纹肌肉瘤细胞(RD细胞)由江西省疾病预防控制中心病毒所提供。

1.1.2 病毒株 EV71(编号：SZK2141/2012)由江西省疾病预防控制中心病毒所提供并分离培养，在人RD细胞中进行扩增，经过3次冻融后离心(12 000×g，10 min),取上清，分装后-80℃保存备用。

1.1.3 药物 瑞香素购自上海士峰生物科技有限公司，纯度≥98%。利巴韦林(ribavirin, RVB)购自天津药业集团新郑股份公司，纯度≥98%。

1.1.4 试剂和仪器 含链霉素青霉素高糖MEM培养液(北京Solarbio科技有限公司)；胎牛血清(美国GIBCO公司)；DMSO(天津大茂化学试剂厂)；Cell Counting Kit-8(上海BestBio贝博生物)；0.25%胰酶(美国GIBCO公司)；EV71核酸测定试剂盒(上海之江生物科技有限公司)。二氧化碳培养箱(湖南长沙长锦科技有限公司)；净化工作台(苏州净化设备厂)；倒置显微镜(XSZ-D重庆光学仪器厂)；紫外分光光度计(美国Thermo Scientific公司)；7500 Fast实时荧光定量PCR系统(美国Applied Biosystems公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 严格按照细胞培养无菌操作要求，对RD细胞进行复苏培养、传代至第3代，使细胞处于对数生长期。RD细胞的培养条件为含10%胎牛血清的MEM 高糖培养基，置37℃、5%CO2孵箱中培养。

1.2.2 病毒扩增 10%胎牛血清MEM生长培养基培养RD细胞，至细胞铺满培养瓶瓶底后，2%胎牛血清MEM维持培养基，接种200 μL EV71病毒液，置37℃、5%CO2孵育至细胞病变效应(CPE)达“+++～++++”(细胞病变达75%～100%)。经过3次冻融后离心(4℃，12 000×g，10 min)，去除细胞碎片，取上清，分装，每支0.5 mL，于-80℃保存备用。

1.2.3 病毒滴定 取1×105·mL-1的RD细胞100 μL加入96孔细胞培养板，每孔约1×104个细胞，置37℃、5%CO2孵箱中培养，长满成单层后(约48 h)，接种病毒；将病毒原液用MEM维持培养基按10倍倍比稀释(10-1，10-2，……10-8)100 μL/孔，加入已吸去培养基的96板中，严格按照要求培养，每日镜下观察细胞病变情况，培养7 d，确定细胞不出现明显病变的最低稀释浓度, 运用Karber法计算半数组织培养感染剂量(TCID50)。公式如下：lgTCID50=L-D(S-0.5) (L：最高稀释度的对数；D：稀释度对数之间的差；S：阳性孔比率总和。)

1.2.4 瑞香素毒性检测 按“1.2.3”方法常规培养RD细胞48 h至单层贴壁状态；将瑞香素溶解于10 μL DMSO中，再用MEM维持培养基稀释，使瑞香素的终浓度为40、30、25、20、15、12.5、10、7.5、6.25、5、3.125 μg/mL。各取100 μL加入到已经弃去培养液的RD细胞培养板上，每个浓度设置4个复孔，另设4孔正常细胞孔(MEM维持培养基代替药物组)和空白对照孔(只加MEM维持培养基的调零组)，置于37℃、5%CO2孵箱中培养72 h，在培养结束前3 h于每孔加入10 μL CCK8溶液。酶标仪450 nm波长处读取吸光度值(OD)。按以下公式计算RD细胞的存活率；得出瑞香素最大无毒浓度(TC0)，并用统计软件SPSS的回归法计算50% 细胞毒性浓度(TC50)。细胞存活率(%)=(药物作用组平均OD值-空白对照组OD值)/(正常细胞组平均OD值-空白对照组OD值)×100%

1.2.5 瑞香素体外抗EV71检测 实验分组设为：(1)正常细胞组：不加药物及EV71干预RD细胞；(2)病毒对照组：EV71+RD细胞；(3)瑞香素组：不同浓度的瑞香素+EV71+RD细胞(瑞香素浓度根据“1.2.4”测定的TC0和TC50为15、12.5、10、7.5、5、3.75、2.5、1.875、1.25、1 μg/mL)；(4)阳性药物组：50 μg/mL RVB +EV71+RD细胞。将100 μL RD细胞接种于96孔细胞培养板培养48 h后，吸弃上清液，分两种给药方式进行：(1)病毒感染后给药：除正常细胞组加100 μL MEM维持培养基外,其余3组均加入100TCID50病毒100 μL吸附1 h，吸去病毒液后，病毒对照组更换成100 μL MEM维持培养基；瑞香素加入100 μL含不同浓度的瑞香素的MEM维持培养基；阳性药物组100 μL 50 μg/mL RVB的MEM维持培养基。37℃和5% CO2条件下培养72 h。(2)病毒感染时给药：将各组药物(不同浓度的瑞香素及50 μg/mL RVB)与100TCID50病毒混合于MEM维持培养基中37℃孵育2 h，将100 μL混合液接种在RD细胞上。将两种给药方式下的96孔细胞培养板置于37℃、5%CO2孵箱中培养72 h，在培养结束前3 h于每孔加入10 μL CCK8溶液。酶标仪450 nm波长处读取吸光度值。按以下公式计算病毒抑制率。病毒抑制率(%)= (药物作用组平均OD值-病毒对照组平均OD值)/ (正常细胞组平均OD值-病毒对照组平均OD值)×100%

1.2.6 病毒载量的测定 同上培养RD细胞48 h，根据CCK8实验结果显示，采用两种作用方式(即病毒感染后给药、药物与病毒同时加入)；并根据“1.2.5”结果设定瑞香素浓度为15、10、7.5、5、2.5 μg/mL)；利用EV71核酸测定试剂盒(Real-time-PCR)检测病毒载量。循环设置：45℃ 10 min，95℃ 15 min，再按95℃ 15 s至60℃ 60 s，循环40次，单点荧光检测在60℃，反应体系为25 μL。

2 结果

2.1 病毒滴定 TCID50法测定繁殖的EV71病毒滴度，将有病变的孔标记，按公式计算。结果显示，EV71病毒滴度为10-5.9/0.1 mL，即将EV71病毒稀释10-5.9倍后接种100 μL可使50%的细胞发生病变。实验时采用病毒的浓度为100TCID50。

2.2 瑞香素对RD细胞存活率的影响 不同浓度的瑞香素作用RD细胞72 h，有不同的作用效果。瑞香素浓度为3.125～25 μg/mL时，镜下细胞形态未发生明显改变，细胞存活率较正常细胞组差异无统计学意义(P>0.05)。当瑞香素为20 μg/mL和25 μg/mL时，细胞的存活率分别降至83.55%和65.66%，低于正常细胞组；而瑞香素浓度为30 μg/mL和40 μg/mL时，细胞的存活率分别降至59.00%和48.04%，明显低于正常细胞组，差异有统计学意义(P<0.05)。因此，瑞香素最大无毒浓度(TC0)为15 μg/mL，通过回归法计算出TC50为33.47 μg/mL。见表1、图1。

瑞香素浓度(μg/mL)存活率4048.04±0.02∗3059.00±0.01∗2565.66±0.022083.55±0.0315106.61±0.0712.5103.81±0.0910106.46±0.067.5108.25±0.116.25108.75±0.015107.16±0.173.125103.50±0.090(正常细胞组)100.00±0.11

*与正常细胞组比较P<0. 05

*与正常细胞组比较 P<0.05，n=4

2.3 瑞香素对病毒EV71 抑制率的影响 采用不同浓度瑞香素作用病毒感染细胞，观察瑞香素对病毒EV71 抑制率的影响。根据2.2结果设定瑞香素浓度为15、12.5、10、7.5、5、3.75、2.5、1.875、1.25、1 μg/mL。

2.3.1 病毒感染后加药 上述浓度瑞香素作用后，对EV71病毒感染均有一定的抑制效果，且呈剂量依赖性。瑞香素浓度为1～3.75 μg/mL时，病毒抑制率在17.58%～34.97%；瑞香素浓度为5～10 μg/mL时，病毒抑制率在55.73%～69.31%，瑞香素浓度为12.5、15 μg/mL时，病毒抑制率为86.39%、82.00%，与正常细胞组相比差异无统计学意义(P>0.05)，瑞香素浓度为7.5～15 μg/mL时，而与阳性药物组(50 μg/mL RVB)比差异无统计学意义(P>0.05)。见表2、图2-A。

2.3.2 病毒感染时加药 上述浓度瑞香素和EV71病毒混合培养后，对EV71病毒都有一定的抑制效果。瑞香素浓度为1～10 μg/mL时，其病毒抑制率在11.03%～46.46%之间；而瑞香素浓度为12.5、15 μg/mL的病毒抑制率分别为97.25%、69.06%，与正常细胞组比差异无统计学意义(P>0.05)。瑞香素浓度为12.5 μg/mL时，与阳性药物组(50 μg/mL RVB)比病毒抑制率亦明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，瑞香素浓度为3.75～10，15 μg/mL时，与阳性药物组比差异无统计学意义(P>0.05)。见表2、图2-B。

药物浓度(μg/mL)病毒感染后期病毒感染期瑞香素1582.00±0.308 69.06±0.390瑞香素12.586.39±0.20997.25±0.040∗瑞香素1069.31±0.25138.56±0.410瑞香素7.562.88±0.13246.46±0.370瑞香素555.73±0.24534.29±0.390瑞香素3.7534.97±0.35238.39±0.270瑞香素2.529.75±0.30321.32±0.300瑞香素1.87527.37±0.40511.03±0.300瑞香素1.2524.00±0.32212.34±0.290瑞香素1 17.58±0.00012.63±0.0000(正常细胞组)100.00±0.227100.00±0.230RVB 5090.10±0.10846.09±0.020

*与阳性药物组比较P<0.05

A：病毒感染后期；B：病毒感染期；◇与阳性药物组比较 P<0.05

2.4 瑞香素对病毒载量的影响 采用RT-PCR进一步观察瑞香素对病毒载量的影响。根据2.3结果设定瑞香素浓度为15、10、7.5、5、2.5 μg/mL。

2.4.1 病毒感染后加药 浓度为15、10 μg/mL的瑞香素在EV71病毒感染后用药对EV71有较好的抑制效果，其病毒载量下降，与病毒对照组相比有显著性差异(P<0.05)。见表3、图3-A。

2.4.2 病毒感染时加药 浓度为15、10、7.5 μg/mL的瑞香素与EV71病毒混合培养后，对EV71病毒有较好的抑制效果，其病毒载量下降，与病毒对照组相比有显著性差异(P<0.05)。见表3、图3-B。

瑞香素浓度(μg/mL)病毒载量病毒感染后期病毒感染期158.16±0.060△8.20±0.067△108.07±0.060△8.06±0.066△7.58.15±0.0668.14±0.046△58.63±0.0568.34±0.0802.58.53±0.0938.27±0.1940(病毒对照组)8.50±0.0148.445±0.036

△与病毒对照组比较P<0.05

A：病毒感染后期；B病毒感染期；△与病毒对照组比较 P<0.05

3 讨论

近些年，以EV71感染为主的HFMD在亚太地区的发病率、病死率呈上升趋势，中国作为人口第一大国，婴幼儿多，全国多个地点爆发过HFMD，现已成为国内关注的严重公共卫生问题。EV71感染的HFMD多是重症病情，严重时可致死。目前EV71感染的致病机制尚不明确，未找到关键致病基因，相对临床应用于治疗EV71的相关药物(免疫球蛋白、RVB和Pleconaril等)在体内只有抗病毒活性，不具备抑制EV71诱导的细胞病变效应。随着筛选和分离技术的提高，从中草药中筛选和提取抗 EV71 药物成分已成为近些年国内研究EV71的治疗热点。传统的中药毒副作用小、具有调节免疫功能、抑制病毒复制和镇痛抗炎等多重疗效，研究意义重大。研究表明，小蘖碱以剂量依赖性抑制EV71的活性，主要是通过下调MRK/ERK信号通路和抑制EV71产生的自噬表达来完成的[5]。袁琦等[20]利用体外实验CPE法检测出红景天甲醇冷浸提取物具有抗EV71病毒的活性。穿心莲内酯磺酸盐(喜炎平注射液)通过调节嗜中性粒细胞和T淋巴细胞的直接免疫调节活性，提高机体的免疫力，从而保护小鼠免受致死性EV71攻击[21]。

本实验室多年来对金边瑞香及瑞香素进行了系列研究[18-19,22-25]，前期已经证实的瑞香素的抗炎、抗凋亡、抗肿瘤等相关药理作用，本研究则从另一个角度——“抗病毒”出发，为瑞香素的药用价值提供更多的实验依据。本实验成功地进行了病毒EV71扩增与滴定，并用CPE、CCK8、RT-PCR检测不同浓度的瑞香素对EV71的抑制率，结果显示：瑞香素对RD细胞的TC50为33.47 μg/mL，TC0为15 μg/mL。选取无毒范围的瑞香素浓度作用于病毒感染的不同阶段，结果表明瑞香素在病毒感染期与感染后期均有不同的抑制效果。病毒感染后加入浓度为12.5、15 μg/mL瑞香素，其病毒抑制率为86.39%、82.00%,显示其在该浓度下对病毒有很好的抑制作用，且瑞香素浓度为7.5～15 μg/mL时，与阳性药物组比无显著性差异，显示其在较低的浓度下对病毒仍能具有与RVB相似的抑制效果。而在病毒感染期，瑞香素浓度为12.5、15 μg/mL的病毒抑制率分别为97.25%、69.06%，同样对病毒有很好的抑制作用，且瑞香素浓度为12.5 μg/mL时，与阳性药物组相比抑制率亦明显升高，在浓度为低至3.75 μg/mL时，亦能达到与RVB有相似的抑制作用。同时，对这两阶段提取培养液上清进行RT-PCR检测，浓度为15、10 μg/mL的瑞香素在EV71感染细胞后再用药处理，能有效降低病毒载量；而以浓度为15、10、7.5 μg/mL瑞香素与EV71病毒混合作用于细胞，同样具有降低病毒载量的作用，均对EV71的复制有较好的抑制效果。由此可见，瑞香素在体外有明确的抗EV71病毒作用，其结果为进一步研究其药效提供了有力的实验依据。

目前有研究发现机体免疫调节是抗EV71治疗的另一重要手段，其中巨噬细胞，干扰素(IFN)可均具有较强的抑制病毒作用，通过免疫调节，增强机体抗病毒免疫应答，降低小鼠病死率的作用[26]。而本实验室发现瑞香素具有较好免疫调节作用，可提高Foxp3+Treg细胞水平，调节Th17细胞[19]。因此，用瑞香素治疗EV71感染为主的HFMD具有较好的开发前景，可为抗EV71药物提供了潜在可能性。随着瑞香素浓度的升高，对EV71的抑制作用逐渐增强，但是当浓度超过一定值时，抑制率也不再上升，可能与瑞香素对RD细胞产生的双向调节作用有关。由此可见，瑞香素在体外有明确的抗EV71病毒作用，可望为治疗EV71感染的HFMD，以及瑞香素抗病毒分子机制研究提供实验依据。