余丹纯，聂玉强，黄耀星，孙小娟

广州市第一人民医院消化内科，广东 广州 510180

活化白细胞黏附分子(activated leukocyte cell adhesion molecule，ALCAM)也称CD166，是一种广泛存在于人体各个组织器官的糖蛋白，是免疫球蛋白超家族的成员之一，已有研究证实，其在胃癌组织中高表达，且与转移有关[1-3]。微小RNA(miRNA)是真核生物中一类21～25个核苷酸的非编码小分子RNA，在进化上具有高度保守性，通过与靶基因mRNA 3′端非编码区(3′untranslated region，3′UTR)互补而抑制或促进靶基因mRNA降解或抑制其翻译，从而对基因进行转录后的表达调控，作为一类潜在的癌基因或抑癌基因发挥作用[4-6]。探讨研究靶向调控ALCAM的miRNA，可能为胃癌的治疗提供新切入点。本研究运用生物信息学软件预测靶向调控ALCAM的miRNA，并通过双荧光素酶报告基因系统、SYBR Green荧光定量PCR和Western blotting等实验技术检测验证其靶向调控作用。

1 材料与方法

1.1细胞和主要试剂人正常胃黏膜GES-1细胞株和SGC-7901、MGC-803、BGC-823胃癌细胞株由ATCC引入，实验室冻存。质量浓度为100 g/L的胎牛血清、RPMI 1640培养基、DMEM培养基购自Gibco公司；DH 5α购自广州博川生物科技有限公司；限制性内切酶Sgf I和Not I购自NEB公司；pEASY-Blunt Cloning Vector购自北京全式生物技术有限公司；psiCHECK-2及Dual Luciferase Reporter Assay System购自Promega公司；miR-NC、miR-9 mimics、miR-9 inhibitor购自Ambion公司；总RNA和总蛋白提取试剂盒、PCR引物、Lipofectin 2000购自Invitrogen公司；逆转录试剂盒、SYBR Green试剂盒购自TaKaRa公司；鼠抗人ALCAM单克隆抗体购自Thermo Fisher Scientific公司。

1.2生物信息学预测调控ALCAM的miRNA采用MiRanda、TargetScan和Pictar 3个生物信息学软件对调控ALCAM的miRNA进行预测，选择3种计算方法预测结果的交集。

1.3细胞培养及实验对象确定将GES-1、SGC-7901、MGC-803和BGC-823细胞株置于质量浓度为100 g/L的胎牛血清的RPMI 1640培养液中，在37 ℃、体积分数为5%的CO2孵箱中培养，每2～3 d用质量浓度为2.5 g/L的胰酶消化传代，取对数生长期细胞进行实验。SYBR Green荧光定量PCR检测各细胞株ALCAM mRNA的表达量，确定实验对象。

1.4总RNA提取及RT-PCR收集细胞，Trizol试剂盒提取总RNA，在Bio Photometer Plus艾本德核酸蛋白测定仪上测定RNA的浓度和纯度，按M-MLV说明书进行逆转录合成cDNA备用。

1.5ALCAM双荧光素酶报告基因载体及突变载体构建运用Primer 5软件设计PCR扩增引物，ALCAM-3′UTR-F：5′-GCGATCGCCCAATTGAAGCATGAACGTGG-3′，ALCAM-3′UTR-R：5′-GCGGCCGCATCTTTTAGGCATAGACGGGTATG-3′，ALCAM-3′UTR-Mut-F：5′-GGGAAA-ATGGTTTCTTATTTGTTTTGCATGGCTAAGCC-3′，ALCAM-3′UTR-Mut-R：5′-CCCCTTTTAGAAACCATTAAATGTTGACCAAGATTC-3′，扩增合成ALCAM 3′UTR和ALCAM-mut 3′UTR片段，片段长度为 1 030 bp，两端带有Sgf I和Not I的酶切位点。将ALCAM 3′UTR和ALCAM-mut 3′UTR片段分别链接至T载体(pEASY-Blunt Cloning Vector)，转化感受态大肠埃希菌DH 5α，LB/Kam培养基筛选克隆成功重组子，分别命名为ALCAM-T和ALCAM-mut-T，送华大基因公司进行基因测序。经测序鉴定后分别提取ALCAM-T/ALCAM-mut-T阳性克隆和psiCHECK-2载体质粒，双酶切质粒，将ALCAM 3′UTR/ALCAM-mut 3′UTR链接至psiCHECK-2，转化感受态大肠埃希菌DH 5α，LB/Kam培养基筛选克隆成功重组子，提取质粒，Sgf I和Not I双酶切鉴定，分别命名为psiCHECK-2-ACALM和psiCHECK-2-ALCAM-mut。

1.6双荧光素酶报告基因活性检测将SGC-7901细胞以1×105ml-1的密度接种于24孔板上(计数后，按5×104个细胞/孔接种)，细胞汇合度为50%～60%时，根据Lipofectin 2000(Invitrogen公司)说明书，每孔加入20 μmol/L的miRNA 1 μl和0.5 μg质粒进行共转染。实验分组如下：(1)未转染的空白对照组；(2)共转染miR-NC、psiCHECK-2-ALCAM或psiCHECK-2-ALCAM-mut；(3)共转染miR-9 mimics、psiCHECK-2-ALCAM或psiCHECK-2-ALCAM-mut；(4)共转染miR-9 inhibitor、psiCHECK-2-ALCAM或psiCHECK-2-ALCAM-mut；每组设4个复孔。转染24 h后，每孔用PBS洗2次，加入100 μl的PLB(Passive Lysis Buffer)，室温轻微振摇15 min，收集细胞裂解液，将20 μl细胞裂解液加入发光板后，用GloMax生物发光检测仪读取背景值2 s，每个样品加入100 μl LAR Ⅱ 工作液，快速混匀，读值2 s，读值完毕后，每样品再加入100 μl Stop & Glo®Reagent，快速混匀后，放入发光检测仪中，读值2 s。保存数据，检测结果分析，F：萤火虫萤光素酶；R：海肾萤光素酶，归一化值=(R/F)样品/(R/F)空白对照。

1.7SYBRGreen荧光定量PCR检测ALCAMmRNA的表达水平运用Primer 5软件设计PCR扩增引物，ALCAM-F：5′-TTTTACTTACCAGGACAGC-3′，ALCAM-R：5′-GACATAGTTTCCAGCATC-3′，扩增片段为327 bp；内参GAPDH-F：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，GAPDH-R：5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′，扩增片段138 bp。总反应体系20 μl，PCR反应条件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 32 s，40 循环，对60～95 ℃升温整个过程进行全程荧光信号收集，绘制融解曲线，每个样本重复3次。2-△△Ct法分析样品中ALCAM基因的相对表达量。

1.8Westernblotting检测ALCAM蛋白的表达水平收集细胞，用RIPA裂解细胞样品并提取总蛋白，BCA法测量蛋白浓度；煮沸变性，经SDS-PAGE凝胶电泳后，将蛋白转膜至PVDF，洗涤封闭，4 ℃冰箱孵育一抗(鼠抗人1∶1 000 ALCAM单克隆抗体)过夜，TBST洗涤，然后室温孵育二抗(羊抗鼠1∶10 000)1 h，以GAPDH为内参，最后用ECL化学法进行曝光、显影；采用灰度分析软件计算ALCAM蛋白相对表达量，实验重复3次。

2 结果

2.1预测miR-9是ALCAM潜在的靶向调控基因应用3个生物信息学数据库(MiRanda、TargetScan和Pictar)预测靶向调控ALCAM的miRNA，结果显示，miR-9是ALCAM潜在的调控miRNA，ALCAM 3′UTR含有1个miR-9的结合位点。

2.2各细胞株中ALCAM基因mRNA的表达SGC-7901、MGC-803和BGC-823胃癌细胞株ALCAM mRNA表达量分别为1.006±0.132、0.675±0.089和0.768±0.078，明显高于人正常胃黏膜GES-1细胞株

(0.004±0.0006)，差异有统计学意义(P<0.05)，其中SGC-7901细胞株mRNA表达水平最高，确定其为实验细胞株。

2.3ALCAM3′UTR和ALCAM-mut3′UTR片段扩增合成成功将ALCAM-T和ALCAM-mut-T送华大基因公司进行基因测序，经测序确认扩增出来的ALCAM基因3′UTR序列是正确的，ALCAM 3′UTR突变后hsa-miR-9-5p结合部位已经突变，如红色框部位所示(见图1)。

2.4miR-9与ALCAM基因3′UTR的相互作用分组转染后通过双荧光素酶报告基因系统进行检测，结果显示，在SGC-7901细胞中，psiCHECK-2-ALCAM质粒共转染了miR-9 mimics的细胞组相对荧光素酶活性(3.717±0.0578)较psiCHECK-2-ALCAM质粒共转染了miR-NC、miR-9 inhibtor的细胞组或空白对照组(5.943±0.051、5.905±0.209、5.988±0.884)明显降低(P<0.05)。而共转染了psiCHECK-2-ALCAM-mut质粒的miR-NC、miR-9 mimics或miR-9 inhibitor的细胞组相对荧光素酶活性(4.572±0.075、4.683±0.157、4.380±0.108)与空白对照组(4.491±0.016)相比，差异无统计学意义(P>0.05)，说明miR-9直接与ALCAM基因3′UTR互补结合而发挥调节作用(见图2)。

图1 ALCAM-mut-T质粒突变部位测序示意图Fig 1 ALCAM-mut-T sequencing of plasmid mutation sites

注：与miR-9 mimics细胞组相比，*P<0.05。图2 miR-9与ALCAM基因3′UTR的相互作用Fig 2 Interaction between miR-9 and ALCAM 3′UTR

2.5miR-9对ALCAM表达的影响通过SYBR Green荧光定量PCR和Western blotting检测miR-9对ALCAM表达水平的影响，结果显示，psiCHECK-2-ALCAM质粒共转染miR-9 mimics的细胞组ALCAM mRNA的表达水平(0.280±0.07)和蛋白表达水平(0.335±0.019)较psiCHECK-2-ALCAM质粒共转染miR-NC、miR-9 inhibitor的细胞组或空白对照组ALCAM mRNA的表达水平(1.015±0.452、2.232±0.522、1.006±0.132)和蛋白表达水平(0.507±0.021、0.754±0.113、0.559±0.029)明显降低(P<0.05)(见图3～4)。

注：与miR-9 mimics细胞组相比，*P<0.05。图3 ALCAM mRNA的相对表达量Fig 3 Relative expression of ALCAM mRNA

注：与miR-9 mimics细胞组相比，*P<0.05。图4 ALCAM蛋白的相对表达量Fig 4 Relative expression of ALCAM protein

3 讨论

多项研究发现，ALCAM在多种肿瘤细胞包括乳腺癌、食管癌和结肠癌中高表达且与患者的预后有关[7-9]。而ISHIGAMI等课题组[1-3]的前期研究则发现了ALCAM在胃癌组织中高表达，且与转移有关。本研究通过SYBR Green荧光定量PCR检测对比人胃黏膜GES-1细胞株及SGC-7901、MGC-803和BGC-823等胃癌细胞株中ALCAM mRNA的表达水平，发现人胃黏膜GES-1细胞株中ALCAM基因的表达量极低，而各胃癌细胞株中ALCAM基因的表达水平升高，再次证实ALCAM在胃癌细胞中高表达，与前期实验结果一致。综上，ALCAM基因与胃癌的发生、发展有关，进一步研究其调控机制将有助于胃癌的治疗及改善预后。

发现和确认肿瘤相关的miRNA可为肿瘤的治疗提供新的切入点。本研究应用MiRanda、TargetScan和Pictar 3个生物信息学软件对调控ALCAM表达的miRNA进行预测，均提示ALCAM 3′UTR有miR-9结合位点，推测miR-9可能是靶向调控ALCAM基因的miRNA。荧光素酶报告基因系统是目前常用的miRNA精确靶点验证方法，其判断原理是：miRNA与报告基因mRNA下游插入的预测靶基因3′UTR序列特异性结合后，将抑制报告基因的表达，与对照组相比，报告基因荧光素酶活性将明显降低。本研究分组共转染miRNA和重组质粒后经双荧光素酶报告基因系统检测发现miR-9明显抑制psiCHECK-2-ALCAM质粒的荧光素酶活性，而对突变体psiCHECK-2-ALCAM-mut的荧光素酶表达无明显影响，说明miR-9直接与ALCAM基因3′UTR互补结合而发挥调节作用。而进一步通过SYBR Green荧光定量PCR及Western blotting检测miR-9对ALCAM表达的影响，发现miR-9显著抑制ALCAM mRNA和蛋白的表达水平。上述实验阐明ALCAM基因在胃癌细胞株中高表达，miR-9直接负性调控SGC-7901胃癌细胞中ALCAM的表达，为今后胃癌治疗的研究提供新方向，值得我们关注和深入研究。