宋士一, 李 莹, 潘俊道, 许志丹, 杨 明

(沈阳师范大学 生命科学学院, 沈阳 110034)

0 引 言

肥胖人口不断增加,现在已成为全球热点问题[1]。在人类和大多数动物模型中,肥胖不仅会增加脂肪组织的脂肪积累,还会导致其他组织和器官内外的脂肪含量增加,即脂肪异位积累[2]。有研究证实肥胖及脂肪异位积累与2型糖尿病、心血管疾病等代谢病之间密切相关[3-4]。

脂肪组织作为重要的储存能量器官,储存脂肪能力是有限的,当达到极限时,血清甘油三酯和游离脂肪酸升高,导致非脂肪组织包括胰腺、心脏、肝脏、肾脏和血管壁中脂肪异位积累,导致细胞功能障碍和细胞死亡,这一过程被称为脂毒性[5-6]。在肥胖人中,肝脏、骨骼肌或胰腺等器官的脂肪异位积累是胰岛素抵抗的关键决定因素[7-9]。实验证实,作为身体重要器官的心脏和肾脏,如果储存了脂肪,就会引发心脏舒张功能不全,血压上升且心率增加,肾功能变化等[10-13],这将直接危及生命。

自然界中的野生动物,长期适应环境温度、食物资源等条件的变化,体重和体脂往往存在年周期的波动。尤其是储脂类冬眠的哺乳动物如熊、旱獭、黄鼠等,通常在越冬前大量储存身体脂肪,即“育肥”,完成脂肪积累后自发进入冬眠,并将身体脂肪作为冬眠期的能源逐渐消耗[14-15]。为探究这些动物的肥胖是否也存在脂肪的异位积累,是否存在肥胖导致相关代谢疾病的风险,本实验用具有冬眠习性的啮齿动物达乌尔黄鼠(Spermophilusdauricus)作为实验模型,探究其育肥过程中重要器官脂肪的积累情况。

达乌尔黄鼠隶属于松鼠科黄鼠属,主要分布于古北界蒙新区,其年周期的生活史特征是每年春季交配繁殖,繁殖期过后(雌性幼子断乳后)开始积累身体脂肪,到秋末完成育肥并进入低代谢和低体温的冬眠状态,经过历时半年的冬眠后于春季出眠并进入下一年的繁殖、育肥、冬眠周期[16]。该物种在育肥期间体重会增加50%甚至更多(达到近300 g,有的甚至会达到400 g),体内脂肪含量会占它们身体的30%,有的达到50%～60%[17]。所以本研究选择育肥期达乌尔黄鼠研究脂肪异位积累。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

本实验所采用的实验动物达乌尔黄鼠,2016年春季捕获于内蒙古通辽市,带回沈阳师范大学实验动物房室温下(21±2) ℃饲养,以标准鼠饲料喂养,水食自取。实验室适应并每周称体重,体重开始增加时按照体重进行分组,作为起始育肥期,此时体重按100%计算为标准(n=8),待体重增加至130%时作为快速育肥期(n=8),体重增加至160%时为育肥完成期(n=7),各时期分别取心脏和肾脏称重、置于冰箱-80 ℃冷藏,保存备用。

1.2 心脏和肾脏甘油三酯含量测定

1.2.1 样品制备

用分析天平称量心脏和肾脏的重量(约0.1 g),按器官重量(g)与无水乙醇体积(mL)1∶9的比例,在玻璃匀浆器中冰上研磨,匀浆液4 ℃离心2 500 rpm,10 min,取上清液用于测定甘油三酯和胆固醇。各称取0.1 g左右心脏和肾脏,加入0.9 mL PIPA裂解液(成分:10 mM Tris(pH=7.0),158 mM Nacl,1% TritonX-100, 5 mM DTT, 1 mM PMSF,蛋白酶抑制剂混合物PIC), 在玻璃匀浆器中,冰上研磨成组织匀浆液4 ℃, 1 2000 rpm,离心10 min。取上清液用于测定样品蛋白浓度。

1.2.2 甘油三酯和胆固醇含量测定

用南京建成生物工程研究所生产的甘油三酯测定试剂盒(货号:A111-0)和胆固醇测定试剂盒(货号:A111-1)用磷酸甘油氧化酶法和单试剂比色法用生成的红色醌类化合物的颜色深浅与甘油三酯、胆固醇的含量成正比测定样品中甘油三酯和胆固醇含量。按照试剂盒使用说明书操作。以蒸馏水作为空白对照。在波长为492 nm下,利用酶标仪(北京普天新桥,型号:PT-3502G)测定吸光度值(OD值),并计算含量。

甘油三酯含量(mmol/gprot)=[(样本OD值-空白OD值)/(校准OD值-空白OD值)]×校准品浓度(2.26 mmol/L)/待测样本蛋白浓度(gprot/L)/5

胆固醇含量(mmol/gprot)=[(样本OD值-空白OD值)/(校准OD值-空白OD值)]×校准品浓度(5.17 mmol/L)/ 待测样本蛋白浓度(gprot/L)/5

1.2.3 蛋白浓度的测定

待测样本蛋白浓度的测定使用北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司生产的BCA蛋白定量测定试剂盒(货号:BCA02)用96孔板法测定。利用BCA与硫酸铜等其他试剂混合在一起,显示为苹果绿色,即BCA工作试剂。在碱性条件下,BCA与蛋白质结合,蛋白质将铜离子还原为亚铜离子,1个亚铜离子整合2个BCA分子,工作试剂由原来的苹果绿色变成紫色复合物,最大光吸收强度与蛋白质浓度成正比。操作方法同上,称取器官重量(g)与RIPA裂解液体积(mL)1∶9的比例研磨并离心,取上清液作为待测样品。按照试剂盒操作说明书操作,在波长为492 nm下,利用酶标仪(北京普天新桥,型号:PT-3502G)测定各孔吸光度值(OD值)并计算蛋白含量。

1.3 数据统计分析

利用SPSS 13.0统计软件包进行数据统计分析,采用单因素方差分析不同时期达乌尔黄鼠心脏和肾脏中甘油三酯和胆固醇含量变化,采用均值±标准误的形式进行比较。(P<0.05,差异显著,P>0.05无明显差异,P<0.01,差异极显著)

2 结 果

2.1 不同育肥期达乌尔黄鼠心脏和肾脏的甘油三酯含量

达乌尔黄鼠育肥过程中起始育肥期、快速育肥期和育肥完成期心脏中的甘油三酯的含量分别为315.6±46.8 mmol/gprot,274.9±50.1 mmol/gprot和368.4±57.8 mmol/gprot,心脏甘油三酯含量在3组之间没有显著差异(P=0.992)(图1)。肾脏中甘油三酯的含量分别为186.0±6.4 mmol/gprot,237.6±6.9 mmol/gprot和265.6±30.9 mmol/gprot,肾脏甘油三酯含量在3组之间没有显著差异(P=0.379)(图2)。

图1 不同育肥期达乌尔黄鼠心脏甘油三酯含量

图2 不同育肥期达乌尔黄鼠肾脏甘油三酯含量

2.2 不同育肥期达乌尔黄鼠心脏和肾脏的胆固醇含量

达乌尔黄鼠育肥过程中起始育肥期、快速育肥期和育肥完成期心脏中的胆固醇的含量分别为70.2±11.7 mmol/gprot, 56.3±11.1 mmol/gprot,和89.8±15.4 mmol/gprot,心脏胆固醇含量在3组之间没有显著差异(P=0.753)(图3)。肾脏的胆固醇含量在育肥过程的起始育肥期、快速育肥期和育肥完成期分别为146.4±7.1 mmol/gprot,158.2±6.8 mmol/gprot,和169.5±13.0 mmol/gprot,3组间不存在明显差异(P=0.802)(图4)。

图3 不同育肥期达乌尔黄鼠心脏胆固醇含量

图4 不同育肥期达乌尔黄鼠肾脏胆固醇含量

3 讨 论

达乌尔黄鼠属于典型的贮脂类冬眠动物,会在冬眠前的夏秋季节大量进食,在体内储存大量脂肪,从而导致了体重的大大增加,已有的研究表明其体重的增加主要是体脂含量增加导致的[17]。对其它动物的研究也表明,动物体重的变化与体脂变化密切相关[18]。动物刚开始肥胖时,脂肪细胞可以保护非脂肪细胞,使脂质储存在脂肪器官中而避免脂质的异位积累,且非脂肪细胞内有调节脂肪的内稳态系统[19]。但过度肥胖后,脂肪器官自身的储存能力和调节能力不足,会出现脂肪异位积累,进而导致疾病[16,20]。

研究表明,甘油三酯或胆固醇含量的增多是引发心血管、冠状动脉疾病及二型糖尿病等代谢疾病的重要原因[21-23]。本实验对达乌尔黄鼠不同育肥期的心脏,肾脏两大器官中甘油三酯和胆固醇的含量测定结果显示,不同育肥期的达乌尔黄鼠无论是心脏,还是肾脏中的甘油三酯和胆固醇均无明显的变化,一直保持着一个比较平稳的水平,表明该物种在育肥过程中不存在脂肪在心、肾等重要器官中的积累。

由于心脏是脊椎动物最重要的一个器官,通过为血液流动提供压力,以供应氧和各种营养物质,并带走最终的产物。肾脏具有内分泌和泌尿双重的作用,调节机体内环境稳态,如果有多余的脂质就会增加心脏和肾脏的负担。有实验证实,喂养高脂食物后的实验动物,它们的心脏和肾脏的脂肪含量均有所增加,而引发了心脏和肾脏的功能紊乱[10-13]。但也有不同与上述情况例证,即便肥胖也没有代谢性疾病,我们称之为“健康肥胖”[24]。所谓“健康肥胖”即为新陈代谢健康的肥胖个体。但新陈代谢健康的肥胖人群的患病概率比正常体重人群的患病概率要高[25],因此,即便新陈代谢健康也不意味着完全健康。达乌尔黄鼠在育肥期会大量进食,即便如此,它们心脏和肾脏的脂质含量并没有明显的改变。且有实验结果:育肥期的达乌尔黄鼠血糖、血脂也没有出现异常[26]。鉴于以上结果可得出达乌尔黄鼠可作为“健康肥胖”的实验动物模型。