费静 孙世元 王涛 魏晓英 张回飞

摘 要：物种相近、理化性质相同的特种动物纤维在外观形态上十分相似，难以鉴别，常见的有羊绒/羊毛，驼绒/羊驼绒等。然而，羊绒中的紫羊绒，与细度相近的牦牛绒混合在一起，更难辨别，是检测中的难点，也是目前市场掺假的主要原因。目前，特种动物纤维的检测主要借助显微镜或者电镜观察形态而鉴别，依赖检验人员的经验进行判断，主观性较强。本研究从毛发自带的物种特异性的DNA出发，借助荧光定量PCR技术，建立羊绒和牦牛绒的定量标准曲线，实现这两种混合物的定量检测。

关键词：羊绒;牦牛绒;荧光定量PCR;DNA定量检测

中图分类号：TS137

文献标志码：A

文章编号：1009-265X（2019）05-0034-05

Abstract：It is hard to identify the fibers of some special animals with close relation in species， physical and chemical properties due to the similar appearance， such as cashmere/wool and camel hair/alpaca fiber. It is even difficulty to identify purple cashmere when it is mixed with yakwool which owns the similar diameter. This is also the main reason of adulteration in the market. Nowadays， special animal fibers are mainly identified by microscopic or SEM examination according to their fiber appearances， which is limited and subjectively by experience of detection personnel. This research focused on species-specific DNA extracted from animal hair， and a quantitation standard curve for cashmere and yakwool was established with the help of fluorescent quantitative PCR technology to achieve quantitative detection of the mixture of the two.

Key words：cashmere; yakwool; fluorescent quantitative PCR; DNA quantitative detection

隨着人们对绿色生活方式的倡导，传统的特种动物纤维产业又蓬勃发展起来。羊毛、羊绒、驼绒、牦牛绒纤维等均为秋冬季最受欢迎的保暖纺织材料。

羊绒产自山羊，是山羊外表皮特有的一层薄薄地掩在粗毛根部的细绒，仅占动物纤维总产量的0.2%，羊绒以纤细、滑糯，并兼以柔软、保暖等特点著称，被称为纤维界的“钻石”、“软黄金”，稀缺性和珍贵性导致了羊绒的价格高高在上，远高于一般的羊毛产品。中国是最大的羊绒输出国，产量约占全世界产量的四分之三，出口创汇可观。山羊绒产业是西部经济的助推器，也是牧民增收的主要来源，对西部经济有着重要意义。

牦牛是一种能在高原高寒的恶劣环境下生存的哺乳动物，是牛科动物唯一有纺织利用价值的成员。牦牛被称为高原之舟，生长于青藏高原及其毗邻地区的高寒地带。牦牛厚厚长长的毛层下聚集着细密的绒毛，这些绒毛为牦牛在高寒的天气状况下生存提供了可能。中国是世界上牦牛数目最多的国家，约占全世界总数的90%。牦牛绒很细，直径18～20 μm，长度为35～50 mm，有不规则弯曲，鳞片呈环状紧密抱合，光泽柔和，弹性强，手感滑糯[1]。

绝大多数牦牛绒呈棕色。牦牛绒与紫山羊绒在外表形态上很相似，鳞片的密度、厚度也相近，纤维边缘整齐，平滑，且两者在显微镜下均存在色素团，给鉴别工作带来了困难[2]。一些不法分子利用这一相似性，将牦牛绒充作紫山羊绒坑害消费者，从中牟利。中国现行的标准GB/T 16988—2013《特种动物纤维与绵羊毛混合物含量的测定》对牦牛绒的描述：牦牛绒纤维鳞片张角较小，鳞片密度为100～130个/mm，毛色为黑色、棕褐色。而在一般的光学显微镜下，鳞片并不是很清晰，检测起来费时费力。电镜法成本高，且制样比较烦琐。由于本身带有色素，紫山羊和牦牛绒通常会被制成深色的织物，这就进一步给检测鉴别工作增加了难度[3-4]。图1是显微镜下的紫山羊绒和牦牛绒。

DNA检测近年来在食品、动植物检疫、司法和环境监测中得到广泛应用。荧光定量PCR技术，是一种加入了荧光基团的体外模拟DNA扩增的技术（PCR）。

在PCR反应体系中加入荧光基团，荧光信号的积累在一定程度上反映了整个反应的进度，每增加一条DNA新链就能捕捉到一个荧光分子信号，同步化了荧光信号和PCR产物的积累，最后通过曲线对未知模板进行定性或定量分析[5-6]。

本研究提供了一种基于荧光定量PCR技术的山羊绒、牦牛绒纤维混合物的定量鉴别方法。针对山羊、牦牛的线粒体DNA序列设计物种特异的引物和探针，利用实时荧光PCR技术，建立起山羊绒牦牛绒标准混合物与它们的DNA之间的对应关系。未知样品的检测可以通过对其中山羊源成分、牦牛源成分进行定量检测，通过对照标准曲线求得各自的含量。

1 试 验

1.1 试验材料

用于制作标准曲线的紫山羊绒购自内蒙古，牦牛绒购自专门生产牦牛绒产品的Shokay公司。

1.2 主要实验试剂

毛发抽提、纯化试剂盒（Promega公司，货号DC6701，DC6740）;2×TaqMan universal master Mix（ABI公司，货号4440040）;引物、探针由life science公司合成，具体序列见1.6。

1.3 主要仪器和器具

荧光定量PCR仪（ABI公司，型号7500）;高速涡旋振荡仪;冰箱;天平（梅特勒公司，型号AE240）;液氮冷冻研磨仪（美国SPEX公司，型号6870）。

1.4 标准混合样和标准曲线的制备

使用直径相近的100%的羊绒、100%的牦牛绒纤维自制标准混合样。分别称取羊绒含量为10%，30%，50%，70%，90%，总质量为0.5 g山羊绒、牦牛绒混合物。

1.5 DNA提取

把样品均匀混合，使用液氮冷冻研磨仪或是剪刀粉碎纤维，确保纤维长度小于0.2 mm。使用Promega DNA IQTM毛发抽提试剂盒抽提DNA。称取纤维粉沫10 mg置于1.5 mL离心管中，加入200 μL DTT和150 μL蛋白酶K，56 ℃温浴震荡过夜;第二天加入裂解液700 μL，上下颠倒混合几次;短时间离心沉淀未溶解物质，吸取上清液转移至新的1.5mL离心管中，加入7μL 完全悬浮的DNA IQTM树脂，高速涡旋振荡3 s，室温温浴10 min;高速涡旋振荡2 s，將离心管置于磁分离架上，此时吸附的DNA的磁球紧贴管壁;用移液枪除去含杂质的溶液;再加入100 μL裂解液，高速涡旋振荡2 s，将离心管置于磁分离架上;去除所有的裂解液，加入150 μL洗涤液，高速涡旋振荡2 s，将管子置于磁分离架上，视情况重复洗涤2～3次，除尽洗涤液;打开管盖，空气中干燥5 min;加入70 μL洗脱液，高速涡旋振荡2 s，65 ℃温浴5 min;取出离心管，高速涡旋振荡2 s，置于磁分离架上，小心吸取DNA溶液（整个过程可参见Promega DNA IQTM使用说明）。

1.6 real-time PCR引物设计

收集了NCBI数据库中山羊、牦牛的线粒体基因序列，重点关注了DNA（mtDNA）16S rRNA基因，12S rRNA基因，细胞色素b基因（cytb），控制区（D-LOOP），ND4基因，挑选了种内保守、种间存在差异区域的12srRNA基因区域。所设计的引物和探针见表1。

1.7 Real-time PCR反应体系与扩增条件

2×Taqman universal Master Mix 10 μL，10 μmol/L引物各0.8 μL，DNA抽提液4 μL，2 μmol/L探针2.5 μL，H2O 2.7 μL。每个样品山羊引物和探针检测一次，牦牛引物和探针检测一次，每种引物探针3个复孔。扩增程序：95 ℃，10 min;95 ℃，15 s;60 ℃，30 s，共40个循环。使用ABI 7500荧光定量PCR仪扩增。

1.8 标准曲线的建立

使用液氮冷冻研磨仪粉碎标准混合物。对标准混合物进行DNA抽提，每个混合比例4个独立的样品。根据步骤1.7进行荧光定量PCR检测。根据荧光定量PCR的数学原理可以推导出，当两个反应的扩增效率非常接近时，羊绒与牦牛的比值的对数与两者对应的Ct值之差存在一定的关系。

对仪器采集到的针对每个标准混合物的山羊绒Ct值记为Ctcashmere，牦牛绒Ct值记为Ctyak，求得Ctcashmere-Ctyak两者的差值ΔCt为横坐标，以log（1/9）、log（3/7）、log（5/5）、log（7/3）、log（9/1）的值为纵坐标，进行曲线拟合，建立定量标准曲线。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

以4个独立批次样品的羊绒检测Ct值与牦牛检测Ct值之差的平均值为横坐标，羊绒和牦牛的比值的对数为纵坐标（表2）取点进行曲线拟合，得一直线（图2），且R2>0.99。

对未知样品，收提DNA，使用山羊、牦牛引物和探针对DNA进行检测，对照标准曲线即可倒推出样品中羊绒和牦牛的含量。

2.2 几个点的验证

使用50%浅棕色、50%深棕色牦牛绒混合物，再与紫山羊绒混合，其中羊绒含量为10%，50%，90%，各取5个独立混合样品进行检测。结果如表3。

2.3 方法应用

使用该方法对1个送检面料，2个CCMI（国际山羊绒驼绒制造商协会）的样品进行检测。样品1 客户申报为100%山羊绒，样品2，3为比对样品。检测结果见表4。

2.4 方法的精密度

通过5个独立实验，对样品1（山羊绒10%/牦牛绒90%）;样品2（50%山羊绒/50%牦牛绒）;样品3（90%紫山羊绒/10%牦牛绒的混合物）进行检测，收集数据对方法的精密度进行评估。5个实验室的数据见表5。

对5个实验室的数据进行柯克伦检验和格拉布斯检验，没有发现有歧离值或离群值存在。分别对3个样品进行统计分析，计算总平均值m，重复性标准差Sr和再现性标准差SR，从而算得重复性限r和再现性限R，结果如表6所示。具体计算公式参考GB/T 6379.2—2004《测量方法与结果的准确度 第2部分 确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法》。

对表6进行分析，方法精密度与平均值之间没有明显的依赖关系。取最R和r作为重复性和再现性的最终值，重复性限r=3.4%，再现性限R=4.8%。

3 结论和讨论

本研究采用了DNA检测手段开展了羊绒、牦牛绒混合物的定量检测，通过构建标准曲线，建立起山羊绒、牦牛绒含量与它们DNA含量之间的关系，实现了山羊绒、牦牛绒定量检测。同时，选择了3个水平的含量对方法的重复性和再现性进行了评定，分别为3.4%和4.8%。

由于紫羊绒、多数牦牛纤维均含有色素，历来是检测的难点。从这两种纤维的遗传物质入手，实现了仪器检测，可以避免检测人员主观因素的影响。由于色素对PCR扩增有抑制作用，在DNA抽提时建议使用磁珠试剂盒法，可以有效去除PCR的抑制因素。

DNA检测，高质量的DNA是基础。所谓高质量的DNA，包含两层意思，一是DNA的量要达到荧光定量检测反应的检测低限，另一层是DNA尽量完整，若链全部断裂则无法检测。机绒处理、后整理中的化学助剂等均会对DNA的完整性造成一定 的影响。而PCR的有效扩增，有赖于两段引物之间的DNA的完整性，将扩增序列设计在线粒体12srRNA上，且大小在70个碱基对左右，可以最大限度地提高有效DNA的利用。

在实际生产过程中，有些企业会对牦牛绒进行剥色处理，为的是使之更容易染色，或是能更接近羊绒外观。遇到这样的样品须格外谨慎，如果仅牦牛绒进行了氧化剥色处理，是无法用DNA方法进行定量检测的，因为氧化剂会对DNA链造成损伤，而两个组分的损伤程度不一致，会使检测的牦牛绒含量偏低[6]。当牦牛绒与羊绒的损伤程度不一致时，定量的结果就会发生偏差。反言之，如果两者进行同样的剥色处理，那损伤程度近似，还是可以利用这个方法进行检测。

参考文献：

[1] 王宏博，高雅琴，李维红.我国牦牛种群资源及其绒毛纤维特性的研究状况[J].经济动物学报，2007，11（3）：169-170.

[2] 苏琼.牦牛绒、绵羊绒纤维与山羊绒纤维的比较[J].上海毛麻科技，2015（4）：32-35.

[3] SUBRAMANIAN S，KARTHIK T， VIJAYARAAGHAVAN N N. Single nucleotide polymorphism for animal fiber identification[J]. Journal of Biotechnology，2005，116（2）：153-158.

[4] TANG M， ZHANG W， ZHOU H， et al. A real-time PCR method for quantifying mixed cashmere and wool based on hair mitochondrial DNA[J]. Textile Research Journal，2014，84（15）：1612-1621.

[5] LU W， FEI J， YANG J， et al. A novel method to identify yak fiber in textile[J]. Textile Research Journal， 2013，83（8）：773-779.

[6] 費静，唐敏峰，杨娟，等.DNA检测技术在天然动物纤维鉴别中的应用[J].纺织导报，2012（5）：90-91.