孟德梅 刘庆艳 郭雅君 樊振川 杨 瑞 生吉萍

（1 省部共建食品营养与安全国家重点实验室 天津科技大学食品科学与工程学院 天津 300457

2 天津科技大学大健康生物技术研究所 天津 300457

3 中国人民大学农业与农村发展学院 北京 100872）

自1972年Boman等[1]在惜古比天蚕中首次发现天蚕抗菌肽以来，人们在细菌、真菌、两栖类、昆虫、植物、哺乳动物、人类体内等都发现了抗菌肽，种类超过3 400多种，现收录于抗菌肽库http：//aps.unmc.edu/AP/中[2]。抗菌肽的来源不仅非常广泛，而且具有相对分子质量小（通常为30～60个氨基酸），强阳离子性，良好的热稳定性、酸碱稳定性和蛋白酶稳定性以及抑菌谱广等多种优点[3]，能够选择性地抑杀细菌或真菌。此外，还具有抗病毒，促进细胞愈合，免疫调节等作用[4]，在医药、养殖和食品等行业都有广阔的应用前景。然而，目前抗菌肽的应用面临着两大难题：首先是天然抗菌肽的抗菌活力较差，其次是抗菌肽的稳定性、溶血活性和细胞毒性难以调控[5-7]。随着人们对抗菌肽分子结构及功能机理的深入研究，在理论知识的基础上，开始对其进行设计改造，期望获得更加高效、稳定及安全的抗菌肽产品[8-9]。本文结合近年来国内外研究的进展，就如何对抗菌肽进行结构改造以增强其活性，而不增加溶血性和细胞毒性进行概述。

1 抗菌肽的结构与功能

1.1 抗菌肽的分子结构

1.1.1 一级结构 大多数抗菌肽的氨基酸数少于100个，而且不同物种同一抗菌肽的氨基酸数目及比例不同[2]。抗菌肽的N端富含亲水性氨基酸如His、Lys等。C端富含有非极性疏水性氨基酸，如Ala、Val。这种两亲性结构对抗菌肽结合细菌的细胞膜发挥重要作用，改变细胞膜的通透性从而产生抑菌活性[2]。一般情况下抗菌肽的一级结构不稳定，但在疏水性的环境中可通过转换成高级结构，保持一定的稳定性，从而发挥抑菌作用[2]。

1.1.2 二级结构 抗菌肽的二级结构主要为α-螺旋、β-折叠、β-发夹结构（loop 结构）及延伸结构（无序结构）。其中，α-螺旋型抗菌肽因其数量较多，分布较为广泛，并且具有广谱抗性特征，是目前广泛研究的抗菌肽[10]。正常情况下，抗菌肽并没有表现出统一的4种二级结构，当抗菌肽与细胞膜接触进入与脂质结合的疏水部分才会表现出一些特定的二级结构[11-12]。

1.1.2.1 α-螺旋 α-螺旋型抗菌肽的N端和C端分别呈亲水性和疏水性，形成了带正电荷的两亲性结构，这种结构对抗菌肽破坏细菌细胞膜发挥着极其重要的作用[13-15]。此类抗菌肽的α-螺旋之间有Pro或Gly形成的铰链区[16]。而且大多数α-螺旋型抗菌肽由于不含有Cys，分子内二硫键无法形成，常见的有 cecropins[17]，piscidins[18]，Magainins[19]，但是也有特例，如lactoferricin[20]。

1.1.2.2 β-折叠 反向平行的β-折叠及分子内二硫键是此类抗菌肽的主要结构特征。分子内二硫键对抗菌肽结构的稳定性极其重要，使其更易于穿过细菌的细胞膜[21]。近年来，研究发现，β-折叠型抗菌肽包含一种γ-核心区域（含两个反平行的β-折叠），而且这个区域在许多动物防御肽中均有出现，这说明了γ-核心区域是宿主防御肽的保守区域[22-24]。β-折叠抗菌肽中含有1个二硫键的有brevinins[25]，Tachyplesin[26]等；含有 2 个二硫键的有protegin-1（含有典型的发夹结构）[27]等；含有3个二硫键的有Mytichitin-CB[28]等。

1.1.2.3 β-发夹结构 此类抗菌肽的C末端含有一个分子内二硫键，使Loop结构得以形成。Loop结构含有二硫键形成的β-折叠结构，有的也含有α-螺旋片段，而其N端保持着线性结构。这类抗菌肽有bactenecin[29]。

1.1.2.4 伸展性片层 该类抗菌肽不含有Cys，通常富含Gly和Pro等。Pro和Gly富集形成的铰链结构阻断抗菌肽分子产生α-螺旋或β-折叠，最终可形成无序的线性卷曲结构。这类的抗菌肽有indolicidin[30]。

1.1.3 三、四级结构 抗菌肽在特殊环境下还表现出一定的高级结构。Won等[31]通过对抗菌肽GGN4的研究，结构表明抗菌肽GGN4在水溶液中并没有表现出固定的三级结构，但是在脂质溶液中不仅具有β-折叠结构，还有α-螺旋结构。采用核磁共振的方法对抗菌肽GGN4的三维结构进行研究，结果发现，GGN4在50%TFE水溶液和80%甲醇水溶液中表现出了不同的三维结构。O-man等[32]对乳酸链球菌肽研究发现，该肽在水溶液中表现出的结构较为灵活，而在DMSO或TFE的溶液中的分子结构相对稳定。

1.2 抗菌肽的抑菌机理

不同种类的抗菌肽对同一类型菌的抑菌机理，以及同一种类的抗菌肽对不同类型菌的抑菌机理都是不同的。目前假设的作用机理有破坏细胞膜形成[33-39]；抑制细胞壁的形成[35，40-43]；抑制细胞呼吸作用[44]；与细胞内生物大分子核酸[45-47]，蛋白[48-49]结合，影响了基因转录表达和调控，进而对细胞内蛋白的结构和功能产生影响。然而，无论哪种机制都要经过吸引、附着、插入、定向几个过程，与细菌细胞进行接触。

α-螺旋型抗菌肽通常是凭借静电引力结合到细菌细胞膜上。其C端凭借疏水作用与磷脂结合，插入细胞质膜，使细菌细胞膜结构破坏。而且抗菌肽分子的单体会不断聚集，导致形成的离子通道孔径不断增大，使得内容物不断流出，最终致使细菌死亡[13-15，50]。

β-折叠和β-发夹结构抗菌肽的抑菌机理与α-螺旋型抗菌肽相似，都是依赖于两亲性结构特点，破坏细菌的细胞膜致其死亡[51]。此外，研究发现，抗菌肽β-defensin可阻碍细菌细胞的形成，使细胞形态异常，最终使细菌死亡[52]。

伸展性片层结构的抗菌肽在细胞质发挥作用。抗菌肽利用Pro、Gly铰链区的扭曲及弹性的性质，穿过细菌细胞膜，进入到细菌细胞质中与核酸或蛋白质结合，影响了基因转录表达及调控，进而使细胞内蛋白质的结构和功能受到影响，最终致使细菌死亡[53]。

1.3 抗菌肽的选择性机理

细菌及真菌细胞表面的膜脂成分都含有负电荷，而哺乳动物细胞膜脂成分则以中性的磷脂为主。带正电荷的抗菌肽通过静电引力靶向地与细菌和真菌细胞结合，对哺乳动物细胞基本无害，因此具有选择杀伤性[54]。然而，有研究表明，疏水性太高会使抗菌肽丧失这种选择性，这是因为抗菌肽疏水性的增强，提高了抗菌肽分子间的疏水作用，更易发生自聚合。这种聚合作用的产生，虽然使得抗菌肽裂解细菌细胞膜的能力提高，但是降低了其通过细菌细胞壁的能力，而与哺乳动物细胞的细胞膜结合效率增加，最终提高了抗菌肽对哺乳动物细胞的溶血活性[55]。因此，可以通过改变抗菌肽的疏水性来优化对其原核细胞膜和真核细胞膜的选择性，同时保持其抑菌能力。

2 抗菌肽活性的调控因素

2.1 正电荷

大多数抗菌肽在自然pH下带正电荷，而带正电荷的性质是抗菌肽的重要特征之一。抗菌肽的这种特征使得它可通过正负电荷之间的静电引力与带负电荷的细菌细胞膜结合，使细菌细胞膜破裂或形成孔洞[56]。正电荷数目的增加不仅可以提高抗菌肽与细菌细胞膜的结合能力，还能有效降低抗菌肽的杀菌浓度[57]。2006年，Ahn等[58]将抗菌肽Tenecin 1的α-螺旋区域的氨基酸用Arg、Lys替代，增加了其净电荷数量，从而赋予了其抗菌活性，而且并没有增加其溶血活性。2009年Carvalho等[59]将Rr-AFP2的第39位的Gln用Lys替换，抗菌活性增强，然而，将第44位Lys替换为Gln时，抗菌活性降低；表明并不是在所有位置增加正电荷的数量都可以使其抗菌活性增强。

研究表明，当正电荷数量到达一定数值后，抗菌肽的抗菌活性不但没有提升，反而有所下降，而其溶血活性有所增加[60]。Zhu等[61]将抗菌肽LV13K进行了氨基酸的替换，得到了净电荷数从-5到+10不等的一系列类似物。研究结果表明：净电荷数较低时，抗菌肽抑菌活性较低；当净电荷数从+4增长到+8时，抗菌肽的抑菌活性有所提高；当净电荷数由+8增长到+10时，抑菌活性保持稳定或有所下降，而其溶血活性却明显升高。这是由于过高的正电荷数使抗菌肽分子之间的静电斥力增大，并超过了抗菌肽与细菌细胞膜的静电引力，从而不利于抗菌肽和细菌细胞膜的结合，使抗菌肽的抗菌活性降低。Gagnon等[62]研究发现正电荷对抑菌活性的影响还与肽链的长度有关。肽链长度相同的情况下，当肽链较长时，带有较多正电荷的抗菌肽的抑菌效果优于少量正电荷的抗菌肽；当肽链较短时，用Lys取代Ile后，正电荷数目增加，然而抑菌活性降低。

综上所述，控制抗菌肽的净电荷数目在+4到+8的范围内有助于提高其抗菌活性。可通过替换氨基酸的方法适当改变亲疏水性氨基酸的数目或顺序，可提高抗菌肽的抗菌活性。值得注意的是，电荷数目变化对抑菌活性的影响还与肽链长度有关。

2.2 疏水性

抗菌肽的疏水性是影响抗菌肽抗菌活性的重要因素之一[63]。疏水性太低致使抗菌肽与细菌细胞膜的亲和力过低，无法与之结合；太高的疏水性易使抗菌肽自我聚集，不仅抗菌肽分子的溶解性降低，并且会导致其溶血活性增加。氨基酸侧链的疏水性和侧链间的疏水相互作用是影响其疏水性的主要因素[50，64]。

Lee等[65]分别将抗菌肽HP的Gln16和Asp18用Trp替代，提高了抗菌肽的疏水性，研究发现它们的抗菌活性得到了提高；其中疏水性最高的抗菌肽其抗菌活性也最高。Zhu等[54]研究表明，提高抗菌肽的疏水性，其抗菌活性得到提高，而抗菌肽的溶血活性也提高，而且溶血活性提高的幅度大于抗菌活性提高的幅度，即降低了抗菌肽的治疗指数。Ayman等[66]研究表明，增加抗菌肽的疏水力矩和疏水性使得抗菌肽的抗菌活性降低，溶血活性增加；降低疏水力矩和疏水性，使抗菌肽的溶血活性降低。

综上可知，疏水性对抗菌活性的影响比对溶血活性的影响程度小。对于较低疏水性的抗菌肽，可通过适当增加疏水性氨基酸的数量来增强抗菌活性，同时避免其溶血活性的增加。对于较高疏水性的抗菌肽，可降低其疏水性使其选择杀伤性增加，溶血活性降低。

2.3 螺旋度

α-螺旋结构在抗菌肽肽链的N端易于形成，可通过替换氨基酸来提高其螺旋性，使其稳定性提高[67]。例如，蜂毒素N端的Gly被去除或被Leu代替，其螺旋性提高，同时也使抗菌活性及溶血活性升高[68]。然而，这种活性的改变是综合影响的结果，因为螺旋度的变化会影响净电荷数、疏水性及疏水力矩等的变化。Gagnon等[62]在保持正电荷数目和肽链长度不变的情况下，将Ile用Lys替代后，发现抗菌肽的抑菌活性因螺旋度的消失而降低。有报道指出在净电荷数和疏水性不受影响的前提下，用不利于螺旋形成的D-型氨基酸替换L-型氨基酸，可以使其螺旋含量降低[69]，而低螺旋度也是降低溶血活性的有效方法[70]。

此外，大量研究表明，抗菌肽的螺旋性对动物细胞毒性的影响要比其抑菌活性更为显著，而D-型氨基酸是控制螺旋性的关键因素[71]。Oren等[72]将抗菌肽melittin B中的4个L-型氨基酸用其同分异构体D-型氨基酸替换后，仍能保持其原有的电荷和亲疏水性，然而α螺旋结构由原来的73%降低为15%，最终降低了抗菌肽对哺乳动物的细胞毒性，可以保持其原有的抑菌活性。Papo等[73]对D-型氨基酸多肽和L-型氨基酸多肽结构与功能进行分析，结果表明D-型氨基酸与L-型氨基酸相比，表现出较低的溶血活性及较高的抑菌活性和水溶性。此研究结果为解决抗菌肽的细胞毒性提供了新思路。

2.4 两亲性

α-螺旋结构具有水脂两亲性[74]；亲水性氨基酸与疏水性氨基酸分别集中分布在α-螺旋抗菌肽的N端与C端，形成亲水端与疏水端[75]。疏水力矩是用于对多肽的两亲性指标的定量描述[76]。研究表明，平均疏水力矩对抗菌活性的影响要大于螺旋度和疏水性对抗菌活性的影响，具有较强裂解细菌细胞膜能力的α-螺旋型抗菌肽大部分都具有较高的疏水力矩[75]。因此，适当调节疏水力矩有利于抗菌肽活性的提高。

Pathak等[77]研究表明，降低Melittin的疏水力矩，其抗菌活性和溶血性也会降低。Fazren等[78]合成了两端分别为疏水性氨基酸和强阳离子氨基酸的两亲性短肽，并证明了其具有抗菌活性。Fernandez等[79]通过L型和D型氨基酸交替排列，设计出了仅含8个氨基酸残基的α-螺旋型多肽链，并证明了这条氨基酸肽链的抑菌活性较强。

2.5 特殊氨基酸及氨基酸数目

研究表明，抗菌肽多肽链中某些特殊的氨基酸残基跟其抑菌活性有密切联系。如富含Arg和Val的α-螺旋抗菌肽的抑菌活性较高，其原因是这类抗菌肽具有更强的静电膜吸附作用[80]。此外精氨酸可以使阴离子膜上的磷脂形成环形孔[81]，缬氨酸可促进β-折叠片层的延伸[82]。

研究表明Pro和Gly的富集对于线性状的抗菌肽的生物活性发挥着极其重要的作用。抗菌肽与膜脂之间的氢键对抗菌肽维持活性结构至关重要[83]。脯氨酸是最保守的氨基酸，它决定了抗菌肽的作用方式是进入细胞膜与胞内大分子发生作用。Lee等[84]通过人工合成抗菌肽P1（KWKLFK KIPKFLHLAKKF-NH2），并分别逐一切除其 C端和N端的氨基酸，结果发现Pro对其抗菌活性发挥着重要作用。有研究发现约70%的抗菌肽的第一位氨基酸残基为Gly，抗菌肽的氨基酸序列的第一个氨基酸是Gly的这种特征有利于抗菌肽结构的稳定[85]。因此，在设计合成抗菌肽时，使Gly尽可能作为肽链的第一个氨基酸。

此外，抗菌肽结构的稳定性也受肽链长度的影响，从而抑菌活性也受到肽链长度的影响。Phambu 等[86]通过红外（FTIR）、扫描电镜（SEM）、热重分析（TGA）及微分扫描量热法（DSC）研究（RW）n表明理想的肽链长度可以增加分子内氢键作用，从而保持肽链的稳定性，进而与阴离子的脂质更好结合，发挥更强的抑菌作用。Gagnon等[62]在保持电荷数目不变的情况下，通过改变KIA序列长度，发现序列长度只有在一定范围内才能保持较高的活性。抗菌肽要进入细菌细胞质膜内发挥抑菌作用，必须先穿过细菌细胞壁和细胞膜。因此，抗菌肽抑菌活性的大小和细菌细胞壁以及细胞膜的厚度有关，也就意味着抗菌肽多肽链长度是影响其抑菌活力大小的关键因素之一[87]。

3 小结与展望

影响抗菌肽活性的因素多种多样，如正电荷数、螺旋度、亲疏水性、疏水力矩、特殊氨基酸以及肽链的长度等，这些因素相互联系并相互制约。充分了解这些因素对其活性和选择性的影响，并对各个方面有一个整体的把握，将更加有利于对抗菌肽结构做有针对性的设计改造。在尽量保留抗菌肽本身结构优势的前提下，通过氨基酸的替换，杂合肽的构建，化学库组合法设计全新抗菌肽等改造手段，得到具有高抑菌活性、高稳定性和低溶血活性、低细胞毒性的新型抗菌肽，这将会是近年来抗菌肽发展的重要方向。而且随着结构生物学的发展，抗菌肽的三维结构被进一步精确测定，计算机图形、图像显示技术和生物信息学的发展，使得抗菌肽结构与功能关系以及分子设计得以在三维结构上进行定性、定量研究。这将对抗菌肽的发展和广泛应用起到至关重要的推动作用。