周洁 郭凤领 符家平 肖颖 徐绳武 吴金平

摘 要：为了明确明日叶（Angelica keiskei）叶斑病病原菌链格孢（Alternaria alternata）的生物学特性而进行了室内药劑筛选，为该病的防治提供理论依据。以蔬菜种质创新与遗传改良湖北重点实验室保存的明日叶叶斑病病原菌为材料，对病原菌的生物学特性进行测定，并在室内对11种药剂进行筛选。链格孢（Alternaria alternata）菌丝生长致死温度为55 ℃;适宜pH范围为8～10;最佳氮源为酵母浸出物，最佳碳源为甘露醇;稀释1 000倍的60%苯醚甲环唑水分散粒剂和稀释2 000倍的32.5%苯甲嘧菌酯悬浮剂对该病原菌抑制率达50%以上。综合以上结果，明日叶叶斑病病原菌适宜在弱碱性和富含有机营养的环境下生长，可选用苯醚甲环唑和苯甲嘧菌酯作为田间防治药剂。

关键词：明日叶;叶斑病;链格孢;生物学特性;药剂筛选

Pathogen biological characteristics and fungicide-screening for leaf spot disease of Angelica keiskei

ZHOU Jie1， GUO Fengling1， FU Jiaping1， XIAO Ying1， XU Shengwu2， WU Jinping1

（1. Hubei Key Laboratory of Vegetable Germplasm Enhancement and Genetic Improvement / Institute of Economic Crops， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan 430064， Hubei， China; 2. Xianning Academy of Agricultural Sciences， Xianning 437000， Hubei， China）

Abstract： The experiment was conducted to clarify the biological characteristics and fungicide-screening of Alternaria alternata， the pathogen of leaf spot disease of Angelica keiskei， to provide a theoretical basis for the controlling of the disease. The biological characteristics of A.alternata were determined， and 11 kinds of fungicides on pathogens was screened. The lethal temperature of mycelium growth was 55 ℃; the optimal pH range was 8 to 10; the best nitrogen source was yeast extract， the best carbon source was mannitol; 1 000 times solution of 60% difenoconazole water dispersible granules and 2 000 times solution of 32.5% azoxystrobin suspension showed best inhibition effect， and the mycelial growth inhibition rate exceeded 50%.The pathogen of leaf spot disease of A. keiskei is suitable for growth in a weak alkaline and organic-rich environment. Difenoconazole and azoxystrobin can be used as control agents in field.

Key words： Angelica keiskei; Leaf spot; Alternaria alternata; Biological characteristics; Fungicide-screening

明日叶（Angelica keiskei），又名明日草、八丈草、长寿草等，是多年生草本植物，属伞形科当归属的药食两用蔬菜，有“21世纪健康食品”和“神奇植物”的美称[1]。明日叶原产于日本八丈岛，含有人体所需的多种维生素、氨基酸、矿物质和微量元素等，同时还含有查尔酮、类黄酮及香豆素等天然活性成分，利于人体健康[2- 3]。此外，有研究发现，明日叶所含的膳食纤维也可为食品工业提供丰富的纤维功能成分来源[4]。随着明日叶功能的不断挖掘，明日叶被引进中国，并被推广规模化种植。未曾关注的病害问题也日渐显现，如由链格孢（Alternaria alternata）引起的叶斑病[5]，导致产量损失近40%，制约了明日叶产业的健康发展。因此，明确该病病原菌的生物学特性及室内药剂的筛选，可为明日叶叶斑病的防治提供理论依据。目前关于明日叶的研究多在功能成分方面，有研究发现明日叶的抗血栓功能，对阿尔茨海默氏病引起的记忆缺陷的改善，明日叶提取物异烟肼酮的抑脂功能等[6-8]，对生产种植中病害的关注相对较少。研究表明，2017年湖北武汉地区发生明日叶叶斑病，经鉴定其致病菌为链格孢（Alternaria alternata）[5]，而未见该致病菌生物学特性及室内药效等相关方面的报道，笔者以此为切入点开展研究，对导致明日叶叶斑病的链格孢进行生物学特性测定及室内药剂筛选，为进一步防控该病害提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

明日叶叶斑病病原菌链格孢（Alternaria alternata）（MG661807）由湖北省农业科学院经济作物研究所蔬菜栽培实验室分离并保存，于2018年7月取出活化备用。11种化学药剂于市场采购，详见表1。

1.2 方法

1.2.1 病原菌致死温度的测定 试验方法参考郭强等[9]的方法。取保存的病原菌接种于PDA培养基平板上进行活化，待菌落生长3 d后，用打孔器于菌落边缘处打取直径为9 mm的菌块放置于1.5 mL离心管中，在不同温度梯度下水浴10 min后接种于PDA平板，24 h后观察菌丝生长情况。水浴温度为30～65 ℃，每隔5 ℃为1个处理。每个处理3次重复。

1.2.2 不同pH对病原菌菌丝生长的影响 用HCl和NaOH分别将PDA的pH调至4、5、6、7、8、9、10和11共8个梯度后倒平板，用打孔器于菌落边缘处打取直径为9 mm的菌块接于不同pH的PDA平板中央，25 ℃的恒温培养箱中培养3 d，采用十字交叉法测量菌落直径，测得数据平均值减去菌块直径9 mm，即为菌落生长直径。每个处理3次重复。

1.2.3 氮源和碳源对病原菌菌丝生长的影响 以查氏（Czapek）培養基[10]为基础培养基，以0.2 %的添加量分别添加甘氨酸、酵母、硫酸铵、硝酸钾、蛋白胨、磷酸二氢铵、硝酸铵、L-谷氨酸钠或硝酸钠，配制不同氮源培养基，以无氮源培养基为对照;以3 %的添加量分别添加葡萄糖、D-果糖、α-乳糖、甘露醇、麦芽糖、可溶性淀粉或蔗糖，配制不同碳源培养基，以无碳源培养基为对照。用打孔器于菌落边缘处打取直径为9 mm的菌块分别接于不同的培养基正中央，25 ℃的恒温培养箱中培养3 d，采用十字交叉法测量菌落直径，测得数据平均值减去菌块直径9 mm，即为菌落生长直径。每个处理3次重复。

1.2.4 杀菌剂对病原菌的生长抑制作用的测定 利用菌丝生长速率法测定供试药剂对病原菌的抑制效果[11]。试验用的市售药剂及使用浓度如表1所示。用无菌水配置药剂母液，参照药剂使用说明以一定的比例加入50 ℃左右的PDA培养基中，使其达到推荐使用浓度，待充分混匀后倒入直径为9 cm的玻璃培养皿中制成平板备用，以无菌水为对照。用打孔器于菌落边缘处打取直径为9 mm的菌块分别接于不同的含药培养基平板正中央，每个处理3次重复，25 ℃的恒温培养箱中培养3 d，采用十字交叉法测量菌落直径，并计算抑菌率，计算方法如下：

抑菌率/%=[（对照菌落直径-初始接种菌饼直径）-（处理菌落直径-初始接种菌饼直径] ×100/（对照菌落直径-初始接种菌饼直径）。

1.3 数据分析

试验数据利用SPPS 16.0软件进行统计分析，利用单因素方差分析比较差异显著性。

2 结果与分析

2.1 病原菌致死温度的测定

将菌块在不同温度下水浴10 min后，观察菌丝生长，当在温度低于55 ℃时，24 h后均能长出菌丝;当温度等于或高于55 ℃，24 h后菌丝不再生长。由此可见，明日叶叶斑病病原菌的致死温度为55 ℃。

2.2 不同pH对菌丝生长的影响

病原菌在不同pH的PDA平板上培养3 d后的生长情况如图1所示，病原菌在pH值为4～11时均能生长，随着pH的升高病原菌的生长速度加快，当pH为8～10时，病原菌生长速度最佳，当pH继续升高时，病原菌的生长变缓。

2.3 氮源和碳源对病原菌菌丝生长的影响

病原菌在含不同氮源的培养基上培养3 d后的生长情况如图2所示，病原菌对不同氮源的利用率存在显著差异，由高到低分别为酵母浸出物>硝酸钠>L-谷氨酸>硝酸钾>蛋白胨>甘氨酸>硝酸铵>磷酸二氢铵>硫酸铵，对酵母浸出物的利用率最高，对硫酸铵和磷酸二氢铵的利用率最低，而对甘氨酸、硝酸钾、蛋白胨、L-谷氨酸和硝酸钠的利用率差异不明显。由图3可得，病原菌对不同碳源的利用也存在一定差异，由高到低分别为甘露醇>麦芽糖>α-乳糖>可溶性淀粉>蔗糖>D-果糖>葡萄糖，对葡萄糖利用最低，而对甘露醇、麦芽糖、α-乳糖和可溶性淀粉的利用率均相对较高。

2.4 杀菌剂对病原菌抑制作用测定

由表1可知，在含药培养基上培养3 d后测量统计可得，对该病原菌的菌丝生长抑制效果最佳的是稀释1 000倍的60%苯醚甲环唑水分散粒剂和稀释2 000倍的32.5%苯甲嘧菌酯悬浮剂，抑菌率均超过50%;稀释600倍的30%噁霉灵水剂、稀释500倍的30%苯甲·丙环唑乳油和稀释1 000倍的38%甲霜福美双可湿性粉剂对病原菌的抑菌率达40%左右;而其他药剂在推荐使用浓度下对病原菌的抑制效果较差，其中稀释500倍的50%多菌灵可湿性粉剂和木霉菌水分散粒剂的抑菌率最低，均未超过3%。

3 讨论与结论

作为一种药食兼用型蔬菜，明日叶在营养价值和保健功能上具有巨大的开发潜力和应用前景[2]。目前，对明日叶的研究主要在功能营养成分等方面，对其生产种植及病虫害的关注相对较少，随着明日叶的种植面积日益扩大，病虫害的发生也开始显现，笔者在前期对明日叶叶斑病病原菌鉴定的基础上，对病原菌的生物学特性进行了测定，同时在室内进行了药剂筛选，为明日叶叶斑病的防治提供了理论依据。

链格孢是植物病害的一种重要致病菌，在多种植物上引起叶部病害，如中华猕猴桃褐斑病、非洲菊叶斑病、白菜黑斑病、牡丹黑斑病、红橘褐斑病[12-16]等。本试验中明日叶叶斑病由链格孢（Alternaria alternata）引起，对该病原菌的生物学特性测定发现，其致死温度为55 ℃，最适pH范围为8～10，最佳氮源为酵母浸出物，对甘露醇、麦芽糖、α-乳糖和可溶性淀粉等碳源的利用率均较高，与番茄黑斑病病原菌（Alternaria alternate）的适宜pH和最佳碳氮源相似[17];在室内防治药剂筛选试验中，稀释2 000倍的32.5%苯甲嘧菌酯悬浮剂和稀释1 000倍的60%苯醚甲环唑水分散粒剂对该病菌的抑制效果最佳，抑菌率均超过50%，与木薯白点病致病菌链格孢的杀菌剂敏感性测定结果一致[18]。有研究表明，来源不同的链格孢病原菌对药剂的敏感性存在明显差异[14]，苯醚甲环唑对引起辣椒叶斑病的链格孢属病原菌的抑制作用相对较好，丙环唑和苯醚甲环唑对引起玉米大斑病的链格孢的抑制效果也较显著，与本试验的研究结果相似。由此可见，三唑类内吸性杀菌剂对链格孢抑制效果相对稳定;而异菌脲对核桃褐斑病和玉米大斑病的防治效果均十分显著，但前人研究表明，链格孢易对异菌脲产生抗药性，因此笔者并未对异菌脲进行防治效果进行测定[19-21]。

明日叶叶斑病致病菌适宜在高温高湿、弱碱性和富含有机营养的条件下生长，而明日叶性喜凉，生长适宜温度为12～22 ℃，因此在不影响明日叶正常生长的情况下，适当降低种植环境温度可能对叶斑病的发生起到一定防控作用。田间防治药剂可选择苯醚甲环唑等三唑类杀菌剂，但由于环境因素的影响，田间的防治效果还有待进一步验证。

参考文献

[1] 吴敬章，王磊，张菊平.明日叶的价值及其开发利用[J].中国野生植物资源，2015，34（5）：60-61.

[2] 刘畅，王正武，吴金鸿.药食兼用植物明日叶的研究进展及应用[J].食品与药品，2013，15（3）：205-209.

[3] 陆香珍，李群，李子超.明日叶查尔酮制备方法与抗衰老作用研究进展[J].食品研究与开发，2018，39（5）：219-224.

[4] XIE F，WANG Y Q，WU J H，et al.Functional properties and morphological characters of soluble dietary fibers in different edible parts of Angelica keiskei[J].Journal of Food Science，2016，81（9）：2189-2198.

[5] WU J P，ZHOU J，JIAO Z B，et al.First report of Angelica keiskei leaf spots caused by Alternariaalternata in China[J].Plant Disease，2019，103（6）：1426-1426.

[6] OHKURA N，ATSUMI G，OHNISHI K，et al.Possible antithrombotic effects of Angelica keiskei （Ashitaba）[J].Die Pharmazie-An International Journal of Pharmaceutical Sciences，2018，73（6）：315-317.

[7] LEE J，KIM H J，KIM D H，et al.Angelica keiskei improved beta-amyloid-induced memory deficiency of alzheimer's disease[J].The Korea Journal of Herbology，2019，34（3）：1-7.

[8] LEE H，LI H，KWEON M，et al.Isobavachalcone from Angelica keiskei inhibits Adipogenesis and prevents lipid accumulation[J].International Journal of Molecular Sciences，2018，19（6）：1693.

[9] 郭強，马文清，陈海生，等.广西崇左市甘蔗梢腐病病原菌的分离鉴定及生物学特性测定[J].南方农业学报，2019，50（8）：1728-1734.

[10] 黄薇，袁斌，万鹏，等.不同钾钠比的查氏培养基对大丽轮枝菌生物学性状及致病力的影响[J].湖北农业科学，2016，55（22）：5815-5820.

[11] 蒋妮，胡凤云，叶云峰，等.罗汉果新病害斑枯病病原鉴定及防治药剂室内筛选[J].植物保护，2015，41（6）：173-177.

[12] 赵金梅，高贵田，谷留杰，等.中华猕猴桃褐斑病病原鉴定及抑菌药剂筛选[J].中国农业科学，2013，46（23）：4916-4925.

[13] 刘芳，高原，张竞颐，等.北京地区非洲菊叶斑病病原菌鉴定[J].菌物学报，2010，29（1）：22-25.

[14] 肖长坤.白菜种传黑斑病菌分子鉴定及抑菌药剂初探[D].北京：中国农业大学，2004.

[15] 石良红，赵兰勇，吴迪，等.山东牡丹黑斑病的病原菌鉴定与 ITS 序列分析[J].园艺学报，2015，42（3）：585-590.

[16] 陈昌胜，黄峰，程兰，等.红橘褐斑病病原鉴定[J].植物病理学报，2011，41（5）：449-455.

[17] 乔镜澄，刘宇，马敬昊，等.番茄黑斑病病原菌的鉴定及生物学特性研究[J].江苏农业科学，2017，45（10）：94-97.

[18] 蔡吉苗，时涛，李超萍，等.中国木薯白点病发生调查及病原生物学特性研究[J].热带作物学报，2019，40（1）：130-138.

[19] 吴松.泾阳线辣椒炭疽病和叶斑病生物学特性研究及防控药剂筛选[D].陕西杨凌：西北农林科技大学，2018.

[20] 王芳，李桃，陈文胜.7 种杀菌剂对玉米大斑病病原菌的毒力测定试验[J].中国农学通报，2018，34（22）：132-139.

[21] 张敏.枣缩果病互隔链格孢菌侵染特性及抗药性研究[D].河北保定：河北农业大学，2018.