朱海生 王彬 刘建汀 陈敏氡 李永平 张前荣 温庆放

摘 要：为了建立一套快速、简单、准确、高效的西葫芦种子纯度检测方法，以西葫芦‘福美1号及其亲本为试验材料，利用SSR 分子标记技术鉴定杂交种子纯度。从114对SSR引物中筛选出了1 对引物（SGSSR25），在杂交种和父、母本之间存在显著差异的条带，且杂交种含有父、母本的特异互补带型。利用该引物对23株‘福美1号杂交种进行纯度鉴定，结果为91.30%，与大田种植鉴定结果一致，表明该引物可用于‘福美1号杂交一代种子纯度的快速检测和准确鉴定，SSR分子标记技术应用于西葫芦杂交种子纯度检测具有可行性。

关键词：西葫芦;SSR分子标记;种子纯度

Analysis of genetic diversity in squash by SSR markers

ZHU Haisheng， WANG Bin， LIU Jianting， CHEN Mindong， LI Yongping， ZHANG Qianrong， WEN Qingfang

（Fujian Engineering Research Center for Vegetables / Vegetable Research Center， Fujian Academy of Agricultural Sciences / Crops Research Institute， Fujian Academy of Agricultural Sciences， Fuzhou 350013， Fujian， China）

Abstact： In order to establish a rapid， simple， accurate and efficient method for detecting the seed purity of Cucurbita pepo， ‘Fumei No. 1 and its parents were used as experimental materials to identify the purity of hybrid seeds with SSR molecular marker technology in this study. One primer pair （SGSSR25） was filtered from 114 SSR primer pairs. Amplification results showed that there were significant different bands between the hybrids and their parents， and the hybrids contained specific complementary bands between the female and male parents. Twenty three individual seeds were tested with the primer， and the seed purity was 91.30%， which was consistent with the result in the field. The results indicated that the primer SGSSR25 could be used for rapid and accurate identification of seed purity of ‘Fumei No. 1 hybrid generation， and SSR molecular marker technology was feasible for purity detection of hybrid seeds in Cucurbita pepo.

Key words： Cucubita pepo L.; SSR molecular marker; Seed purity

西葫蘆（Cucubita pepo L.）是葫芦科南瓜属的一个种，为一年生蔓性草本蔬菜作物，也叫美洲南瓜，具有较高的营养价值和保健功能，且具有生长期短、产量高、耐贮运、适宜间作套种等优点[1]，深受大众喜爱。西葫芦在我国各地均有大面积栽培，已成为我国瓜类蔬菜的主栽品种之一，栽培面积次于黄瓜[2-3]，并有逐年扩大之势，具有广阔的应用前景和巨大的经济潜力。利用杂种优势，培育一代杂交西葫芦品种是目前西葫芦育种的主要方法。在西葫芦杂交制种过程中，由于人工去雄不彻底或漏去雄等原因，常会出现假杂交种，导致种子纯度下降，给生产造成巨大的经济损失。因此，杂交种品种纯度和种子真实性的准确、简便、快速鉴定成为西葫芦生产中急需解决的问题之一。

随着生物技术的快速发展，从DNA分子水平上对品种种子纯度和真实性进行鉴定和分析成为可能，其中，采用分子标记技术鉴定种子纯度是一种快速、准确、便捷、有效的方法。微卫星序列即简单重复序列（Simple sequence repeat，SSR）分子标记，广泛存在于真核和原核生物基因组中，SSR分子标记具有重复性好、稳定可靠、位点特异、复等位、呈共显性等优点，已经成为最为广泛的分子标记之一[4-5]，也是目前作物品种鉴定和种子纯度鉴定研究中最常用的标记之一[6-7]。笔者利用SSR分子标记技术，筛选出特异性SSR引物，建立一套快速检测西葫芦种子纯度的方法，以期为准确、快速、简单、高效的西葫芦杂交种子纯度鉴定提供参考。

1 材料与方法

1.1 西葫芦SSR分子标记数据来源与筛选

西葫芦转录组数据来源于福建省农业科学院蔬菜研究中心Illumina高通量深度测序结果。委托北京百迈客生物科技有限公司进行RNA-Seq转录组测序，利用Primer 3.0对含SSR位点序列进行引物设计，引物序列长度18～25 bp，扩增产物长度100～280 bp，GC含量40%～60%，退火温度55～65 ℃，共设计出引物7 958对。随机选择其中20 bp以上SSR序列的150对标记进行合成，进行SSR-PCR扩增以验证其有效性。

1.2 材料及其DNA提取

供试材料为西葫芦‘福美1号杂交种及其父母本为福建省农业科学院培育的品种。基因组DNA提取采用CTAB法进行[8]，选取2～3片嫩叶，加入1～2勺的PVP和液氮，迅速研磨成粉状，移入1.5 mL的离心管后加入600 μL预热至65 ℃的 2% CTAB Buffer和β-琉基乙醇7 μL，充分混匀后，65 ℃水浴1 h，期间多次摇匀;室温冷却后加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀静置10 min，在12 000 r·min-1、4 ℃条件下离心10 min;取上清液，加入100 μL 3 mol·L-1 NaAc和300 μL的氯仿/异戊醇充分混匀，离心10 min;再次取上清液，并加入0.6倍体积的异丙醇，混匀至能看到白色絮状物，在12 000 r·min-1，4 ℃条件下离心10 min，75%的乙醇洗涤DNA 2～3次，风干后的DNA溶于100 μL TE溶液，加入2.5 μL RNase A去除RNA，保存于4 ℃或-20 ℃备用。

1.3 西葫芦杂交种‘福美1号纯度鉴定及SSR特异引物的筛选

以‘福美1号杂交种及其父母本为模板，利用1.1筛选的引物进行PCR扩增，筛选能区分‘福美1号杂交种及其父母本的特异性引物。

PCR 扩增时采用的反应体系为：50 ng基因组DNA 1 μL，0.2 mmol·L-1 dNTP 1 μL，500 U Taq DNA聚合酶0.3 μL，0.4 μmol·L-1的引物各1 μL，2.5 μL 10×Buffer，加入灭菌的超纯水至25 μL。PCR扩增程序为：94 ℃预变性3 min;35个循环，每个循环包括94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 min;最后72 ℃延伸10 min，反应结束后于4 ℃保存。PCR扩增产物经PAGE胶电泳银染后观察拍照。

1.4 西葫芦杂交种‘福美1号纯度鉴定

随机抽取‘福美1号杂交种，利用筛选出来的SSR特异引物进行鉴定，结合田间种植鉴定结果，验证利用SSR分子标记鉴定种子纯度的准确性。只有同时具有亲本特异性条带的单株才为真正的杂交种，缺少其中的任意一条带记为假杂种，计算种子纯度。

2 结果与分析

2.1 西葫芦DNA提取与鉴定

应用改良后CTAB法提取的DNA，通过浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳進行检测，结果表明：DNA条带明亮清晰，拖带现象不明显，带形集中。OD260/OD280值在1.7～1.9之间，表示所提取的DNA杂质含量少，纯度较高， DNA适合做进一步的研究（图1）。

2.2 西葫芦SSR分子标记数据来源与筛选

西葫芦转录组经组装后共获得83 650条Unigene，对1 kb以上的Unigene进行搜索，其中5 786条Unigene序列中含有7 478个SSR位点。对含SSR位点的5 786条Unigene序列利用Primer 3.0设计引物，共设计出引物7 958对。选取长度在20 bp以上SSR序列，合成长度18～25 bp、扩增产物长度100～280 bp的引物150对，进行SSR-PCR扩增有效性检测。SSR-PCR扩增结果表明，114对引物实现有效扩增，且带型清晰、重复性好（图2）。

2.3 SSR特异引物筛选

利用114对有效扩增SSR引物对‘福美1号杂交种及其父母本进行PCR 扩增及特异引物的筛选。筛选到共显性差异标记条带的引物SGSSR25，序列为：SGSSR25-F：5- GGCATTTCCTCCCCATTTAT -3;SGSSR25-R：5- AAATATGTGGCCAGCGACTC -3。该对引物能产生父本特异性标记和母本特异性标记，并在‘福美1号杂交种中扩增出互补条带（图3），表明该对引物可用于‘福美1号种子纯度的检测。

2.4 杂交种纯度鉴定

从田间随机选取23株‘福美1号西葫芦，利用筛选得到的特异性引物对SGSSR25进行纯度检测，PCR 扩增结果表明，21株能清晰地扩增出与亲本互补的条带，扩增出父母本特异条带各 1株（图4），种子纯度为91.30%，与田间检测结果一致。

3 讨论与结论

近些年，随着分子标记技术的研究深入，利用分子标记对西葫芦种子进行纯度鉴定成为了一种快速、准确的方法。基于转录组的SSR分子标记较一般的分子标记具有信息量大、通用性好、在基因组序列中分布广泛等优势，在杂交种的鉴定和种子纯度检测方面具有很大优越性，已在多种植物中广泛应用[9-10]。现有的西葫芦SSR分子标记数量有限，大量开发SSR标记仍是目前研究的重要工作之一。笔者利用西葫芦转录组测序获得了SSR标记，筛选出有效扩增且带型清晰、重复性好的SSR引物，为后期西葫芦杂交种子纯度鉴定提供了参考。

传统的田间性状鉴定种子纯度所需周期长、成本高、工作量大，且以播种后植株的田间形态观察为依据，易受外界环境和检测人员水平等因素影响，导致结果存在偏差[11]。分子标记技术较田间形态学鉴定能有效减少鉴定的周期和成本，能快速准确地鉴定杂交F1代种子纯度。SSR分子标记技术直接反映不同品种的遗传基础差异，为种子纯度鉴定提供了一种更准确、快速、简便、高效的方法。SSR标记数量多，带型易于区分判断，能区分纯合基因型和杂合基因型，是一项很有潜力的技术，在黄瓜、青花菜、甘蓝等[12-14]蔬菜中都有相关报道，但是利用SSR分子标记技术鉴定种子纯度时，前提条件是筛选出能特异、清晰地扩增出双亲的特异性条带，且在子代中双亲互补的SSR引物。笔者从114对引物中筛选出1条特异性强的引物SGSSR25，引物SGSSR25能产生父本特异性标记和母本特异性标记，可将西葫芦杂交种子与其父母本区分开来，快速检测出杂交种子的纯度，具有准确、低成本、操作方便等优势，能够代替传统杂交种子纯度鉴定的方法，具有较高的商业应用价值，为西葫芦种子质量控制和纯度鉴定提供了参考依据。

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