石 磊，李 禤，李有全，殷 宏，罗建勋

(1.中国农业科学院兰州兽医研究所,甘肃 兰州 730046；2.青海省海南州动物疫病预防控制中心，青海 海南州 813000)

1940年，Stockstadt首次发现抗生素对畜禽具有促进生长作用。随后，抗生素作为饲料添加剂在畜禽养殖中逐步得到广泛应用。近年来，由于抗生素的滥用导致了诸多副作用，如耐药性、药物残留、动物内源性感染以及破坏微生态平衡等[1]。因此，由于抗药性耐药病原菌的出现，导致人们越来越关注食品安全与卫生[2]。2006年，欧盟全面停止使用任何抗生素生长促进剂[3]。2020年国家规定药物饲料添加剂全部退出，养殖端也进入减抗和限抗时代。因此，寻找某种生物制剂来替代抗生素已成为人类生存和发展的紧迫任务。

益生菌是一种通过改善肠道菌群平衡而对动物产生有利影响的活的微生物，具有抑制病原微生物、调节胃肠道微生物区系、增强免疫应答，有效预防腹泻，促进动物生长发育，提高饲料利用率等多种功能[4-5]。益生菌作为一种重要的替抗(或减抗)产品，以其无耐药性、无毒副作用、无药物残留等优点日益受到人们的关注，目前已成各国科学家关注的研究热点。

董晓丽证实，在哺乳期犊牛代乳品中添加益生菌能够增加日增重，有改善犊牛生长性能的趋势，且减轻了犊牛的腹泻状况[6]。在断奶犊牛日粮中添加益生菌，能够改善断奶前期犊牛的饲料转化率，并影响断奶后犊牛的瘤胃微生物区系。代乳粉或日粮中添加益生菌对哺乳期犊牛和断奶后犊牛的血液生化指标均无显著影响，说明添加益生菌不会影响犊牛的代谢[6]。Bayatkouhsar等研究表明，给初生犊牛饲喂乳酸杆菌后，犊牛的采食量和日增重都有增加的趋势，而且犊牛的最终体重也显著增加[7]；乳酸菌能够代替抗生素作为犊牛的生长促进剂，并取得较好效果[8]。梁海威等研究证实，在鸡饲料中添加植物乳杆菌能提高1-42日龄肉鸡的生长性能，改善血清生化指标，修复攻毒肉鸡的组织器官损伤，降低血清尿素氮水平[9]。Riddell等研究表明,饲喂益生菌的犊牛日增重、饲料转化率、采食量在很大程度上高于未饲喂益生菌的犊牛[10]；口服罗伊氏乳杆菌能够促进肠道蠕动，改善儿童慢性便秘症状，同时对婴儿疝气的治疗有明显的效果[11-12]。在饲料中添加屎肠球菌能够改善仔猪生长性能，防治仔猪腹泻及提高仔猪的免疫能力[13]。

本研究的目的是通过厌氧培养、形态学观察以及分子鉴定技术从健康牦犊牛粪便中分离和鉴定益生菌株，了解犊牛肠道内益生菌的分布种类，为治疗犊牛腹泻、改善犊牛生长性能及提高犊牛的免疫力提供更多的候选菌种。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 分离用培养基为MRS培养基；革兰染色试剂盒；微量生化试验鉴定试剂盒；Taq酶、回收试剂盒等。

1.2 主要仪器 厌氧培养箱；超净工作台；PCR仪。

1.3 样品采集 在青海省共和县江西沟乡，随机采集20头幼龄健康牦牛的新鲜粪便，装入50 mL无菌离心管，编号并置于-20 ℃保存。

1.4 乳酸菌的初筛 无菌条件下称取粪便样品1 g，加入9 mL分离稀释液，振荡混匀，用6层纱布过滤去除杂质。将滤液作为原液，依次进行10倍递增稀释，取100 μL稀释液均匀涂布于MRS固体培养基平板上，厌氧条件下37 ℃培养24-48 h。用接种针挑去疑似乳酸菌的白色或乳白色的溶钙菌落，进行下一步的划线纯化。

1.5 菌种的纯化与保存 将1.4中疑似乳酸菌进行划线纯化培养，连续重复3次以上，最后一次划线后若平板上菌落大小形态一致，无杂菌出现则纯化成功。挑取单个菌落接种于MRS液体培养基中，37 ℃培养24 h，离心，用适宜体积的含30%甘油的MRS液体培养液混匀，分装于冻存管置-80 ℃保存备用。

1.6 菌种的鉴定

1.6.1 形态学观察 进行单一菌种的菌落形态大小、光泽等观察。革兰染色，镜检观察其菌体形态和大小等特征。

1.6.2 生化试验鉴定 使用微量生化试验鉴定试剂盒，按照其操作说明书进行各项生化试验项目的检测。

1.6.3 16S rRNA的序列测定 按照常规方法进行单一菌种基因组总DNA的提取，用细菌通用引物进行分子生物学特征鉴定，正向引物为27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向引物为1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，进行扩增。PCR反应体系(50 μL)：10×Buffer 5 μL，dNTP 3 μL，上、下游引物各0.5 μL，rTap酶0.3 μL，模板DNA 1 μL，加去离子水至39.7 μL。PCR扩增反应程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共35个循环；72 ℃ 5 min。用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，用回收试剂盒回收、纯化后送南京金斯瑞生物科技有限公司测序。将得到的菌株16S rRNA基因序列数据输入GenBank核酸数据库中，利用在线BLAST程序与GenBank数据库中的序列进行比对分析，确定其分类地位。

1.7 菌株的抗药性试验 挑取分离菌株，接种于含抗生素浓度分别为1%四环素、1%土霉素、1%黄连素、1 000 IU/mL链霉素、1 000 IU/mL青霉素钠盐的MRS液体培养基中，观察筛选菌的生长情况。

2 结果

经过初步分离和纯化，从青海省共和县20份新鲜牦犊牛粪便中共获得7株分离菌，其中3株革兰阳性杆菌分别命名L1、L2、L3，4株革兰阳性球菌分别命名为E1、E2、E3、E4。经生化试验鉴定，按照说明书的判定标准，初步判定L1分离菌为罗伊氏乳杆菌，L2分离菌为植物乳杆菌，L3分离菌为保加利亚乳杆菌，E1、E2、E3和E4分离菌疑似为肠球菌。经测序和BLAST比对分析表明，L1的DNA序列与罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)的基因序列相似性达100%，L2的DNA序列与植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)的基因序列相似性达99%，L3的DNA序列与保加利亚乳杆菌(Lactobacillusbulgaricus)的基因序列相似性达100%。E1的DNA序列与乳酸乳球菌(Enterococcuslactis)的基因序列相似性达100%，E2与坚强肠球菌(Enterococcusdurans)的基因序列相似性达100%，E3的DNA序列与海氏肠球菌(Enterococcushirae)的基因序列相似性达100%，E4的DNA序列与屎肠球菌(Enterococcusfaecium)的基因序列相似性达100%。结合分离菌的形态学特征、生理生化特征和分子鉴定特征，确定L1分离菌为罗伊氏乳杆菌(见中插彩版图1)，L2分离菌为植物乳杆菌(见中插彩版图2)，L3为保加利亚乳杆菌；E1分离菌为乳酸乳球菌，E2为坚强肠球菌，E3为海氏肠球菌(见中插彩版图3)，E4为屎肠球菌(见中插彩版图4)。

抗药性试验结果表明，7株分离菌在几种药物中均能生长，但在青霉素中生长比较缓慢，说明7株分离菌均具有较强的抗药性。

3 讨论

益生菌可竞争性抑制病原微生物，使其不能定值、占位、生长、繁殖，促使病原微生物随粪便排出体外[14]。而源自牦牛粪便中的益生菌更有利于适应牦牛特异性肠道环境从而发挥最大功效。

从青海共和县牦牛的粪便样品中分离得到7株乳酸菌，包括罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌、乳酸乳球菌、坚强肠球菌、海氏肠球菌和屎肠球菌各1株。其中罗伊乳杆菌几乎存在于所有脊椎动物和哺乳动物肠道内，对肠黏膜具有很强的粘附能力，可以承受胃酸和胆汁的作用到达小肠的上部粘附于小肠壁，该菌体可分泌胞外物质抑制肠道菌群的粘附定植，避免罹患肠道疾病，能合成并分泌罗伊菌素，是一种非蛋白质类广谱抗菌物质，可有效抑制大肠杆菌、沙门菌、李斯特菌、梭菌、葡萄球菌等有害菌的生长；该菌可作为一种防腐剂用于食品、饲料、饮料；可作为生物抑菌剂，用于不能高压灭菌的牛奶、生物材料的灭菌；作为婴儿食品添加剂调节肠道菌群分布，刺激机体免疫器官的成熟，激活免疫系统，增加抗炎细胞因子的产生，降低肠道的渗透性[15-17]。植物乳杆菌因其代谢产物乳酸、细菌素及蛋白酶等而被作为益生菌应用到畜禽生产中，其能通过维持肠道菌群平衡、促进营养物质消化与吸收和改善肠道微生物代谢对宿主产生益生作用，尤其当动物机体处于应激条件下，其益生功效更为明显。在生长猪饲粮中添加植物乳杆菌，能够改善生长猪肠道菌群环境，提高生长猪生长速度和饲料利用效率[18]。屎肠球菌是乳酸菌中抗逆性较强的一类，具有很好的抗逆性(高温、酸碱、高盐、氧气)，肠道粘附能力好，对抗生素也具备很好的耐受性。据资料显示，该菌进入动物肠道后，主要通过以下四个途径对宿主产生作用：快速粘附肠道黏膜，抑制病原菌的粘附，维持微生态平衡；代谢过程中产生乳酸、细菌素和过氧化氢等物质，降低肠道pH值、抑制病原菌繁殖、减少肠道内毒素与尿素酶的含量、促进动物器官成熟、改善动物生理状态；产生维生素、氨基酸和促生长因子等多种营养物质；诱导机体产生细胞因子、干扰素、白细胞介素等，增强机体非特异性免疫、提高抗病能力、降低炎症反应[19]。

本研究分离的7株乳酸菌，为后期研制抗牦牛腹泻益生菌产品的研究提供了基础。