张海洋 付娆 李茹霞 顾寅钰 梁晓艳 宋延静 李萌 王向誉 郭洪恩

摘要：从菠菜（Spinacia oleracea L.）栽培种中克隆得到1个NHX1基因，命名为SpNHX1。利用生物信息学软件对获得的基因核苷酸序列及编码的蛋白质序列进行分析，结果发现SpNHX1属于Vac亚家族，序列长度为6 090 bp，开放阅读框为1 662 bp，编码553个氨基酸残基。利用相关软件或在线工具对SpNHX1进行生物信息学分析，结果表明其编码蛋白分子式为C2 818H4 363N697O772S25，属于稳定的疏水性蛋白;进化树分析表明SpNHX1蛋白与拟南芥AtNHX1、AtNHX2亲缘关系较近，属于定位在液泡膜上的蛋白，SpNHX1蛋白与双子叶植物的NHX蛋白亲缘关系较近。

关键词：菠菜（Spinacia oleracea L.）;耐盐;SpNHX1;基因克隆;生物信息学分析

中图分类号：S636.1         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2019）23-0211-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.23.052           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Cloning and bioinformatic analysis of SpNHX1 gene from Spinacia oleracea L.

ZHANG Hai-yang，FU Rao，LI Ru-xia，GU Yin-yu，LIANG Xiao-yan，SONG Yan-jing，

LI Meng，WANG Xiang-yu，GUO Hong-en

（Shandong Institute of Sericulture，Yantai 264002，Shandong，China）

Abstract： NHX1 gene was cloned from cultivated spinach （Spinacia oleracea L.） and named SpNHX1. Bioinformatics software were used to analyze the obtained gene nucleotide sequences and protein sequences encoded. The results showed that SpNHX1 belonged to the Vac subfamily， with a sequence length of 6 090 bp， an open reading frame of 1 662 bp， and 553 amino acid residues encoded. The bioinformatics analysis of SpNHX1 was carried out by using relevant software or online tools. The results showed that the molecular formula of its coding protein was C2 818H4 363N697O772S25， which was a stable hydrophobic protein. Evolutionary tree analysis shows that SpNHX1 is closely related to AtNHX1 and AtNHX2 proteins of Arabidopsis thaliana， which belong to proteins located on vacuolar membranes. SpNHX1 protein is closely related to NHX proteins of dicotyledons.

Key words： Spinacia oleracea L.; salt tolerance; SpNHX1; gene cloning; bioinformatic analysis

土壤鹽渍化作为一个普遍的环境问题，已经成为制约农业生产力的世界性难题。大多数作物对土壤中高浓度盐含量很敏感[1]。盐的压力主要是由Na+引起的，高盐胁迫对植物的危害主要是由高浓度的Na+积累所导致的。虽然不同植物的耐盐机制存在差异，但是其基本策略都是保持胞内Na+的平衡[1]。研究显示，植物液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白（Vacuolar Na+/H+ antiporter）在植物抗盐碱的过程中起着至关重要的作用[2-5]，它可以将细胞质中过多的Na+区域化在液泡中，从而使得胞内的Na+处于相对平衡状态，以此来使植物更好地适应盐渍生活。除了离子毒性，渗透压和K+/Na+离子不平衡会导致代谢异常，比如抑制胞质酶活性[6]。为了提高盐碱地的开发利用，研究者一直致力于开发出相关的抗盐碱基因。随着对拟南芥、水稻等植物的抗盐碱分子机理研究的深入，这些植物中的液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因被克隆出来，并且其较强的耐盐能力也得到了证实[7，8]。

1  材料与方法

1.1  试验材料和试剂

新鲜菠菜（Spinacia oleracea L.）叶片采至山东省蚕业研究所日光温室。受体菌株Escherichia coli DH5α购自北京全式金生物工程技术有限公司。Taq DNA聚合酶、IPTG、X-gal、dNTPs、DNA凝胶回收试剂盒、Peasy-cloning blunt载体等购自北京全式金工程技术有限公司;限制性内切酶EcoRⅠ、HindⅢ购自TaKaRa公司;其他生化试剂和常规试剂均为超纯或分析纯。

1.2  基因完整编码区获取

查找SpinachBase（http：//www.spinachbase.org/cgi

-bin/spinach/index.cgi）获取二倍体菠菜的NHX1编码区序列，在SpinachBase中的ID是Spo20154。

1.3  引物设计

根据序列，利用PrimerPremier 5.0软件设计引物，经过PCR引物筛选确定最终引物。SpNHX1正向引物序列为5′-ATGTGGTCGCAGTTAAGCTCTT-3′，反向引物序列为5′-TTATGTTGCTCTGTCTGGCATG

-3′。

1.4  菠菜基因组DNA提取、PCR扩增、克隆测序与序列比对

取菠菜幼苗新鲜叶片，用CTAB法提取基因组DNA。以菠菜基因组DNA为模板，以上述合成的引物进行PCR特异扩增。采用50 μL反应体系，组成为10×PCR缓冲液（不含Mg2+）5 μL，MgCl2（25 mmol/L）5 μL，dNTP混合物（10 mmol/L each）1 μL，上、下游引物（均为20 μmol/L）各1 μL，菠菜基因组DNA（80 ng/μL）2 μL，Taq酶（5 U/μL）0.5 μL，无菌ddH2O 34.5 μL。扩增反应程序为94 ℃预变性5 min;98 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共进行35轮循环;72 ℃延伸10 min。电泳分离PCR产物中的目的条带，用柱式DNA胶回收试剂盒纯化。

1.5  菠菜NHX1基因的生物信息学分析

利用生物信息学数据库对菠菜NHX1进行分析，用Protparam[9]分析NHX1编码蛋白的氨基酸序列组成、分子质量、等电点等理化性质;在NCBI[10]对其保守结构域进行分析。所用主要分析软件的网址为Protparam：https：//web.expasy.org/protparam/;NCBI：

https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi。

利用MEGA 7.0軟件采用NJ法构建系统进化树。

2  结果与分析

2.1  栽培种小叶菠菜NHX1基因全长及编码区序列的克隆及基因结构分析

以山东小叶菠菜基因组DNA为模板，使用设计出的SpNHX1引物，经PCR各扩增出1条6 kb和1.6 kb左右的片段（图1）。通过测序分析获得SpNHX1基因全长及编码区序列信息。经分析，克隆得到的SpNHX1序列长度为 6 090 bp，开放阅读框为1 662 bp，编码553个氨基酸残基。对菠菜SpNHX1基因的结构进行分析，结果表明该基因具有14个外显子区域（图2）。

2.2  菠菜SpNHX1基因编码的氨基酸序列分析

在NCBI对其保守结构域分析的结果如图3所示，NhaP结构域是Na+/H+和K+/H+无机离子逆向转运蛋白的保守结构域;Na_H_Exchanger是Na+/H+交换体家族。Na+/H+逆向转运蛋白是维持细胞所需物质交换的最适pH最关键的逆向转运蛋白，其分子机理目前还不太清楚。这些逆向转运蛋白在氨基末端含有10～12个跨膜区域，在羧基末端有一个大的细胞质区域。M3～M12跨膜区域与家族其他成员是一样的。M6和M7区域是高度保守的。所以，推测这些区域参与了Na+和H+的转运。

2.3  菠菜SpNHX1的生物信息学分析

2.3.1  菠菜SpNHX1基因编码蛋白的理化性质  用ProtParam分析软件对菠菜SpNHX1编码蛋白的理化性质进行预测，推测该蛋白的分子式为C2 818H4 363N697O772S25，分子质量为61.2 ku，等电点为6.76;理论推导其半衰期分别为30 h（体外，哺乳动物的网织红细胞内）、>20 h（体内，酵母细胞内）、>10 h（体内，大肠杆菌）。不稳定参数是31.75，属于稳定蛋白。该基因编码的氨基酸如图4所示，含Leu（L）最多，占13.60%;不含Pyl（O）、Sec（U）;总的带正电残基（Arg+Lys）为36，负电残基（Asp+Glu）为38;总的亲水性平均系数为0.493，预测该蛋白属于疏水性蛋白。

2.3.2  菠菜SpNHX1系统进化树分析  对SpNHX1基因编码氨基酸序列与杨树、拟南芥、苜蓿、大豆、水稻以及玉米NHX基因家族的氨基酸序列进行系统进化树分析，结果如图5所示。菠菜SpNHX1蛋白与拟南芥的AtNHX1、AtNHX2蛋白进化关系较近。NHX主要分为两大类，一类是定位于液泡膜上的蛋白，如AtNHX1、AtNHX2等;另一类是定位于质膜上的蛋白，如AtNHX5、AtNHX6，因此SpNHX1蛋白归属于液泡膜蛋白。同时定位到液泡膜上的蛋白又分为单子叶与双子叶两类，说明单子叶植物和双子叶植物的NHX在进化上存在差异，其中SpNHX1蛋白与双子叶植物的NHX蛋白亲缘关系较近。

3  小结与讨论

随着土壤盐渍化的加重，Na+/H+逆向转运蛋白对植物抵抗外界盐渍环境具有非常重要的意义。本试验从菠菜基因组中得到了编码液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白的SpNHX1基因，对其编码的蛋白质预测结果显示，SpNHX1蛋白具有典型的跨膜结构域，具有NhaP结构域，此结构域是Na+/H+和K+/H+无机离子逆向转运蛋白的保守结构域。系统进化树分析表明，SpNHX1蛋白属于液泡膜型NHX，而且与双子叶植物聚为一类，表明单子叶植物与双子叶植物NHX在进化上可能存在着一定差异，有待于进一步探讨菠菜的耐盐机制。

目前，隨着土壤盐渍化问题的日益加重，依靠分子生物学手段来克隆相关耐盐基因并将其转移到非抗盐作物中，以培育出耐盐转基因新品种显得尤为重要，这不仅可以在一定程度上开发利用盐碱土地，而且对于提高农作物产量具有非常重要的意义。

参考文献：

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[3] YANG Q，WU M，WANG P，et al. Cloning and expression analysis of a vacuolar Na+/H+ antiporter gene from alfalfa[J].DNA Seq，2005，16（5）：352-357.

[4] ZHAO J S，ZHI D Y，XUE Z Y，et al. Enhanced salt tolerance of transgenic progeny of tall fescue（Festuca rundinacea） expressing a vacuolar Na+/H+ antiporter gene from Arabidopsis[J].J Plant Physiol，2007，164（10）：1377-1383.

[5] CHEN L H，ZHANG B，XU Z Q. Salt tolerance conferred by overexpression of Arabidopsis vacuolar Na+/H+ antiporter gene AtNHX1 in common buckwheat （Fagopyrum esculentum）[J].Transgenic Res，2008，17（1）：121-132.

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[8] FUKUDA A，NAKAMURA A，TANAKA Y. Molecular cloning and expression of the Na+/H+ exchanger gene in Oryza sativa[J].Biochim Biophys Acta，1999，1446（1-2）：149-155.

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[10] MARCHLER-BAUER A，BRYANT S H. CD-search：Proteindomain annotations on the fly[J].Nucleic Acids Res，2004，32（Web Server issue）：W327-W331.