ＱｕＥＣｈＥＲＳ法与传统固相萃取法对比检测茶叶中２５种农药残留

2019-01-11卢森华梁爽黎强陈宇庞小莲钟盈盈唐明华

湖北农业科学 2019年23期

卢森华梁爽黎强陈宇庞小莲钟盈盈唐明华

摘要：通过对比QuEChERS法与传统固相萃取（SPE）法，建立了气相色谱-串联质谱法检測茶叶中25种农药高通量定量检测方法。试验考察了QuEChERS法和SPE法中影响提取和净化效果的各个因素，同时对二者的基质效应进行了分析。QuEChERS法中25种农药在33.33～333.3 ng/mL线性关系良好，相关系数均大于0.990，方法的检出限为0.04～3.00 μg/kg，回收率为74.99%～104.71%，RSD为0.4%～9.0%;SPE法中25种农药在25.0～300.0 ng/mL线性关系良好，相关系数均大于0.990，方法的检出限为0.004～0.300 μg/kg，回收率为62.90%～104.04%，RSD为0.2%～6.4%。2种方法的灵敏度和精密度差异不显著，均符合农药残留分析要求，但SPE法较QuEChERS法基质效应小、净化相对彻底，QuEChERS法较SPE法操作简单、检测快速。2种方法均能对茶叶样品进行农药高通量定量检测，确保在食品安全国家标准设定的MRL水平上对茶叶中的农药残留进行检测。

关键词：固相萃取;QuEChERS;茶叶;气相色谱-串联质谱;农药残留

中图分类号：O657.7+1;S571.1 文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2019）23-0176-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.23.044 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Determination of 25 pesticide residues in tea by QuEChERS and SPE

LU Sen-hua1，LIANG Shuang2，LI Qiang1，CHEN Yu1，PANG Xiao-lian1，ZHONG Ying-ying1，TANG Ming-hua1

（1.Yulin Center for Food and Drug Control，Yulin 537000，Guangxi，China;2.Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530001，China）

Abstract： A high-throughput quantitative method for the determination of 25 pesticides in tea by GC-MS/MS was established by comparing the QuEChERS method with the traditional SPE method. The factors influencing the extraction and purification effect of QuEChERS and SPE were investigated， and the matrix effect of them was analyzed. The linear relationship of 25 pesticides in the concentration range of 33.33～333.3 ng/mL was good， the correlation coefficient was>0.990， the detection limit of the method was 0.04～3.00 μg/kg， the recovery was 74.99%～104.71%， and the corresponding RSD was 0.4%～9.0%; the linear relationship of 25 pesticides in SPE was good in the concentration range of 25.0～300.0 ng/mL， the correlation coefficient was>0.990， the detection limit of the method was 0.004～0.300 μg/kg. The recovery was 62.90%～104.04%， and the corresponding RSD was 0.2%～6.4%. There was no significant difference in sensitivity and precision between the two methods， which met the requirements of pesticide residue analysis. However， the matrix effect of SPE method is smaller than that of QuEChERS method， and the purification is relatively thorough. Compared with SPE method， QuEChERS method is simpler in operation and faster in detection. Both of the two methods can be used for high-throughput quantitative detection of pesticides in tea samples to ensure reliable control of pesticide residues in tea at the MRL level set by the national food safety standard.

Key words： SPE; QuEChERS; tea; GC-MS/MS; pesticide residues

茶葉作为一种具有保健功能的饮品深受国内外消费者的喜爱[1]。现代科学研究表明茶叶中含有多种人体所必需的营养成分（如蛋白质、氨基酸、脂类、维生素等），还富含多种对人体有保健作用的药理活性成分（茶多酚、茶多糖、茶色素、茶氨酸等），对减少高血压发病率、抑制动脉粥样硬化、防止免疫功能降低都有功效[2]。茶多酚是一种高效的天然自由基清除剂，具有抗氧化、抗辐射、抗动脉粥样硬化等作用，尤其在抗动脉粥样硬化方面作用突出，能有效降低动脉粥样硬化的发病率和死亡率[3]。因此，饮茶有益于身体健康。但是，为了防治和减少茶树病虫害的危害，农药在茶叶中高度密集使用，农药的使用一方面提高茶叶的产量，但残留的农药却极大地危害人们身体健康，成为茶叶质量安全关注的焦点[4]。2016版食品中最大农药残留限量食品安全国家标准（GB 2763-2016）规定了48项农药在茶叶中的限量要求，而2014版仅规定了28项，新增了20项农药残留限量，限量要求更严[5]。为了适应当前和今后的实际检测工作要求，寻求操作简单、检测时间短、灵敏度高、重现性好的农药高通量定量检测技术，建立一种高效、简便的茶叶中农药多残留分析方法十分必要[6]。农药多残留分析检测技术的关键在于前处理，目前常用的前处理方法为固相萃取法（SPE）[7]，QuEChERS方法是近年来发展起来的一种新型样品前处理技术[1]。本试验在茶叶日常检验项目的基础上，剔除在质谱上灵敏度较差的项目，最终确定25种农药品种作为目标物[8]。通过比较QuEChERS法和SPE法的提取和净化效果，对不同前处理方法的提取溶剂、洗脱溶剂和基质效应等方面进行优化，建立了准确、可靠且能同时测定茶叶中25种农药的高通量定量检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 仪器试验所用气相色谱-串联质谱仪、电子天平等仪器设备的型号及生产厂家见表1。

1.1.2 材料和试剂农药标准品：环氧七氯（德国Dr.公司），批号G121441;25种农药混标溶液，100.0 μg/mL（美国Achemtek公司），批号ALT014109，包括α-六六六、β-六六六、γ-六六六、δ-六六六、克百威、氯唑磷、杀螟硫磷、毒死蜱、三氯杀螨醇、喹硫磷、P，P′-DDE、O，P′-DDD、P，P′-DDD、P，P′-DDT、硫丹硫酸盐、联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氟氰菊酯、哒螨灵、氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、氟氰戊菊酯、氰戊菊酯、苯醚甲环唑、溴氰菊酯。乙腈、甲苯、正己烷，色谱纯（美国Thermo Fisher公司）;无水硫酸钠，分析纯（广州化学试剂厂），用前于650 ℃灼烧4 h，贮于干燥器中，冷却后备用;Cleanert TPT茶叶专用柱，2 g/12 mL（美国Agela公司）;GCB-NH2固相萃取柱，500 mg/6 mL（上海安谱实验科技股份有限公司）;QuEChERS萃取盐包（美国Agilent公司），部件号5982-6755（含6 g无水MgSO4，1.5 g NaAc）;15 mL QuEChERS分散固相萃取管（美国Agilent公司），部件号5982-5456（含400 mg PSA，400 mg C18，400 mg GCB，1 200 mg无水MgSO4）和部件号5982-0029（含400 mg PSA，400 mg C18，45 mg GCB，1 200 mg无水MgSO4）。

1.2 方法

准确称取空白基质试样6份，分别精密加入0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL混合标准贮备液，自“精密加入15.0 mL 1%乙酸酸化的乙腈”起同供试品溶液制备方法制备QuEChERS法系列标准工作溶液。浓度依次均为33.3、66.7、133.3、200.0、266.7、333.3 ng/mL。

准确称取空白基质试样6份，分别精密加入0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.60 mL混合标准使用液，自“加入20 mL乙腈”起同供试品溶液制备方法制备SPE法系列标准工作溶液，浓度依次为25.0、50.0、100.0、150.0、200.0、300.0 ng/mL，内标浓度为50.0 ng/mL。

1.2.1 QuEChERS法

1）提取。称取5.0 g茶叶样品至50 mL塑料离心管中，加入10 mL水，涡旋混匀后，浸提1 h，再精密加入15.0 mL 1%乙酸酸化的乙腈，再涡旋混匀后，倒入QuEChERS 萃取盐包中，盖紧瓶盖并用力振摇2 min，在10 000 r/m下离心5 min，室温静置[9]。

2）净化。移取8.0 mL上述上清液至15 mL

QuEChERS分散固相萃取管（部件号5982-5456）中，盖紧瓶盖并用力振摇2 min，在8 000 r/m下离心5 min;取上层清液，过0.22 μm有机微孔滤膜，用于气相色谱-串联质谱测定[10]。

1.2.2 SPE法

1）提取。称取5.0 g试样，于50 mL离心管中，加入25 mL乙腈，涡旋振荡提取2 min，10 000 r/m离心5 min，取上清液于60 mL浓缩管中。残渣用25 mL乙腈重复提取一次，离心，合并二次提取液，40 ℃水浴中氮吹至1 mL左右，待净化[11]。

2）净化。将上述样品浓缩液转移至TPT茶叶专用柱[柱中加入高约2 cm无水NaSO4，上样前用6 mL乙腈-甲苯（3+1）溶液进行活化]中，下接15 mL浓缩管，用6 mL乙腈-甲苯（3+1）溶液分3次洗涤浓缩管，将洗涤液移入柱中，再用6 mL乙腈-甲苯（3+1）洗涤小柱，收集上述所有流出液于15 mL浓缩管中，40 ℃水浴中氮吹至约0.5 mL。加入5 mL正己烷进行溶剂交换，最后将样液体积定容为2.0 mL，精密加入100 μL内标溶液，混匀，过0.22 μm有机微孔滤膜，用于气相色谱-串联质谱测定[12]。

1.2.3 标准溶液的配制精密量取25种农药混标溶液1.0 mL，置于20 mL量瓶中，用正己烷溶解并稀釋至刻度，摇匀，即得混合标准储备液，溶度均为5.0 μg/mL。再精密量取2.0 mL置10 mL量瓶中，用正己烷定容，即得混合标准使用液，溶度均为1.0 μg/mL。

1.2.4 气相色谱-串联质谱分析条件

1）色谱条件。TG-5MS石英毛细管柱（30 m×250 μm×0.25 μm）。载气为He（≥99.99%），柱流量1.2 mL/min，进样口温度250 ℃，不分流，进样量1 μL，溶剂延迟3.0 min。程序升温：初始温度40 ℃，保持1.5 min，以25 ℃/min升至90 ℃，保持1.5 min，以25 ℃/min升至180 ℃，以5 ℃/min升至280 ℃，以10 ℃/min升至300 ℃，保持5 min[13]。

2）质谱条件。EI源，电子能量为70 eV，灯丝电流25 μA，离子源温度为300 ℃，质谱接口温度为280 ℃，多反应监测（SRM）采集模式。Trace Finder软件自带的数据库包含超过1 000种能在GC上分析的常规化合物，每种化合物都有3对离子对，其中响应最高的1对为定量离子，其他两对为定性离子，25种农药的保留时间、SRM离子对信息、碰撞能见表2[13]。每个化合物SRM质谱条件（母离子-子离子-碰撞能量）可以从Trace Finder软件中的数据库直接导出编辑进样方法和数据处理方法，得到目标物的SRM总离子流见图1。

1.2.5 定性测定样品检测时，样品与标准品检出的色谱峰保留时间（Rt）应在±5%内，在扣除背景后的样品质谱图中所选择的离子对（m/z）均出现，且3对离子对丰度比和相近质量浓度标准品的离子丰度比一致，则可判定样品中存在这种农药[14]。

1.2.6 定量测定 QuEChERS法采用外标法单离子定量测定，SPE法采用内标法单离子定量测定，内标物为环氧七氯。为减少基质的影响，定量用标准溶液采用阴性基质样品溶液配制混合标准工作溶液，标准溶液的浓度应与待测化合物的浓度相近[15]。并且要求曲线相关系数大于0.990。

2 结果与分析

2.1 提取过程

2.1.1 提取溶剂的选择由于被分析目标物的结构差异大和极性范围广，如何将样品中微量的农药目标物提取至有机溶剂中是农药残留分析必须解决的首要问题[16]。由于茶叶中水溶性物质（如茶多酚、茶碱）较多，乙腈作为极性较强的溶剂对大多数农药都能有效提取，且油脂和色素溶出率低，基质干扰小，回收率理想[17]。本试验中SPE法参照GB/T 23204-2008茶叶中519种农药及相关化学品残留量的测定方法，选用乙腈为提取溶剂;QuEChERS法用1%乙酸酸化乙腈为提取溶剂，以提高对碱敏感农药的稳定性。

2.1.2 基质效应基质效应是用质谱分析农药残留时必须考虑的问题，这是由于基质成分的存在减少了色谱系统活性位点与待测物分子作用的机会，使得更多的待测物流入色谱系统从而使检测信号增强[18]。基质效应通常不能被消除，但可以通过一定的途径减小其对定性定量分析的影响。本试验用阴性基质样品溶液配制100 ng/mL混合标准工作溶液和用正己烷配制100 ng/mL纯溶剂标准溶液同时进样，计算基质溶液中农药峰面积与纯溶剂中农药峰面积的比值。结果表明，SPE法的基质效应不明显， QuEChERS法则存在显著的基质增强效应，为对目标物进行准确定量，本试验均采用基质标准溶液对25种农药进行定量分析。

2.2 净化过程

2.2.1 固相萃取柱的选择 QuEChERS法分别比较了部件号为5982-0029和部件号为5982-5456的QuEChERS 分散固相萃取管，由于茶叶中含有大量的色素，增加GCB的使用量，可有效去除较多的色素，避免基质效应。SPE法分别比较了GCB-NH2柱和Cleanert TPT柱，GCB-NH2柱为通用型固相萃取柱，Cleanert TPT柱为茶叶专用固相萃取柱，专属性强。因此QuEChERS法使用部件号为5982-5456分散固相萃取管，SPE法使用Cleanert TPT茶叶专用柱。

2.2.2 洗脱溶剂的选择 Cleanert TPT茶叶专用柱的吸附性较强，仅用乙腈溶液洗脱大部分农药的回收率无法满足检测要求，所以在乙腈中加入了一定比例的甲苯进行洗脱，参照GB/T23204-2008茶叶中519种农药及相关化学品残留量的测定方法用乙腈-甲苯（3+1）溶液为洗脱溶剂。

2.3 线性回归方程和检出限

分别按照1%乙酸酸化的乙腈-QuEChERS净化与乙腈提取-TPT茶叶专用柱净化制备两种不同的基质标准工作液。将25种农药基质标准溶液按试验条件进行测定，以农药的质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，QuEChERS法中25种农药在33.33～333.3 ng/mL与目标物的响应值呈良好的线性关系，相关系数均大于0.990，方法检出限为0.04～3.00 μg/kg;SPE法中25种农药在25.0～300.0 ng/mL与目标物的响应值呈良好的线性关系，相关系数均大于0.990，方法检出限为0.004～0.300 μg/kg。线性回归方程、相关系数及检出限见表3。

2.4 加标回收和精密度

按照QuEChERS法与SPE法对阴性茶叶样品进行加标回收试验，选取高、低2个不同质量分数水平，平行双样测定，计算平均回收率和相对标准偏差（RSD），结果见表4。从表4可知，采用QuEChERS法前处理时，25种农药的平均回收率为74.99%～104.71%，相应的RSD为0.4%～9.0%;采用SPE法前处理时，25种农药的平均回收率在62.90%～104.04%，相应的RSD为0.2%～6.4%。QuEChERS法和SPE法回收率比较结果见图2，结果表明2种方法差异不显著，均能对茶叶样品进行检测，且数据准确可靠，回收率与精密度均符合农药残留分析要求。

3 结论

研究分别采用传统的固相萃取法（SPE）和最新的QuEChERS法进行比较测定茶叶中常见的25种农药残留，对于茶叶中农药残留的检测具有实际应用价值[19]。试验建立了测定茶叶样品中25种农药残留的两种不同前处理检测方法：QuEChERS法采用乙酸酸化乙腈提取，QuEChERS分散固相萃取管净化，GC-MS/MS分析;SPE法采用乙腈提取，Cleanert TPT柱净化，GC-MS/MS检测分析。2种方法的检出限、回收率、准确度和精密度均符合农药残留检测要求，优化了样品制备步骤和气相色谱-串联质谱分析条件赋予方法的性能和指标。但2种方法各有优缺点，QuEChERS法净化粗糙，基质效应较大，但具有操作简单、检测快速、溶剂使用量少，价格低廉且不使用含氯化物溶剂等优点。SPE法净化相对彻底，基质效应较小，仪器的维护成本和频率较低，但其操作相对耗时且溶剂用量大。2种方法适应性和可操作性强，均可用于茶叶中农药残留水平的检测，确保在食品安全国家标准设定的 MRL水平上对茶叶中的农残进行检测。

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