綦国红 巴云英 杨志萍 陈贵堂 王海翔

摘要：研究大蒜提取物对荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）生物膜形成的抑制作用。用结晶紫染色法以及光学显微镜对该菌产生的生物膜进行了研究，苯酚硫酸法测定其胞外多糖的产量，采用多孔板法研究了大蒜提取物与山梨酸钾的协同作用。结果表明，大蒜提取物浓度为100、150 mg/mL时，对生物膜的抑制率分别为27.6%和38.7%;对胞外多糖抑制率分别为4.5%和12.6%;100 mg/mL的提取物与山梨酸钾具有协同作用。因此，大蒜提取物对荧光假单胞菌生物膜的形成具有抑制作用。

关键词：荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）;生物膜;大蒜提取物

中图分类号：TS255.1         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2019）23-0157-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.23.039           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Inhibitory effect of garlic extract on the biofilm formation of Pseudomonas fluorescens

QI Guo-hong，BA Yun-ying，YANG Zhi-ping，CHEN Gui-tang，WANG Hai-xiang

（School of Engineering，China Pharmaceutical University，Nanjing 211198，China）

Abstract： The inhibitory effect of garlic extract on biofilm development in Pseudomonas fluorescens was studied. The biofilm produced by the bacteria was determined using crystal violet staining and light microscope， phenol sulfuric acid method was used to test the production of extracellular polysaccharides， the synergistic effect of garlic extract with potassium sorbate was studied by porous plate method. The results showed that the inhibitory rates of garlic extract on biofilm development were 27.6% and 38.7%， the inhibitory rates on extracellular polysaccharide were 4.5% and 12.6%， respectively， at the concentration of the garlic extract 100 mg/mL and 150 mg/mL， garlic extract showed synergistic effect with potassium sorbate at the concentration of 100 mg/mL. Therefore， garlic extract inhibited the biofilm formation in P. fluorescens.

Key words： Pseudomonas fluorescens; biofilm; garlic extract

荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）广泛分布于土壤、水、植物等自然生物链之中，是一种常见的嗜冷菌，常存在于鱼、肉、奶等动物性食品中，并在冷藏过程中大量生长，导致该类食品的腐败变质。而且该菌在生长的过程中产生生物被膜[1]。生物被膜（又称生物膜）是细菌为了适应生存环境黏附并包被于自体产生的黏液性不均一聚合基质中，形成一种与浮游细胞不同生长方式的群体，而多糖是生物膜主要的构成成分之一。由于生物膜的形成对环境因素的耐受性比浮游菌增加10～1 000倍，所以對抗生素以及食品防腐剂、杀菌剂的抗性明显增强，很难从食品接触面和加工设备上清除，对食品的贮藏和加工带来严重危害[2，3]。因此，研究如何抑制或减少荧光假单胞菌生物膜的形成对食品工业具有重要意义。

大蒜（Garlic）属百合科葱属植物，以鳞茎入药，含有多种有益于人体健康的功效成分，同时具有抗菌作用，对细菌、真菌及病毒等感染均有一定的疗效[4]，但是有关大蒜对生物膜形成的抑制作用的报道却较少。为更好地控制荧光假单胞菌生物膜的产生，增强其对各种防腐剂、杀菌剂的敏感性，本文研究大蒜提取物对荧光假单胞菌生物膜形成的抑制作用，为大蒜的进一步应用提供理论基础。

1  材料与方法

1.1  菌种与培养条件

荧光假单胞菌P2为实验室保存。使用LB培养基（氯化钠10 g，胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，去离子水1 L，pH 7.0）于28 ℃ 150 r/min振荡培养。

1.2  材料与试剂

白皮大蒜购自于当地农贸市场;甲苯（分析纯），上海凌峰化学试剂有限公司;苯酚（分析纯）， 国药集团化学试剂有限公司;浓硫酸（分析纯），南京化学试剂股份有限公司;胰蛋白胨（生物试剂） 北京奥博星生物技术有限责任公司;酵母粉，Oxoid Ltd。

1.3  仪器与设备

HZC-250恒温震荡培养箱（苏州太仓实验设备有限公司）;TU-1901双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）;TGL-16G离心机（上海安亭科学仪器厂）;Elx800多功能酶标仪（美国伯腾仪器有限公司;Microscope  Eclipse 80i光学显微镜（日本Nikon）。

1.4  方法

1.4.1  大蒜提取物的制备  按文献[4]方法，称取 150 g蒜粒，加300 mL甲苯，粉碎机将蒜粒捣成糊状，静置过夜，3 000 r/min离心10 min，得上清液，加入150 mL去离子水，搅拌混匀，室温静置24 h，得水相，无菌过滤，分装，-18℃保藏，备用。粗提物的浓度为1 g/mL。

1.4.2  对荧光假单胞菌最小抑菌浓度（MIC）的测定   按文献[4]方法，P2活化后，按1%接种量接种于新鲜LB培养基，28 ℃ 150 r/min振荡培养至OD600 nm约为0.4。取菌液与提取物按比例混合，大蒜提取物最终浓度分别为200、250、300、350、400、450、500 mg/mL。对照组为LB培养基。于28 ℃ 150 r/min振荡培养14 h，观察各试管生长情况，无菌生长的试管对应的浓度即为最小抑菌浓度。

1.4.3  对荧光假单胞菌生长的抑制作用  按“1.4.2”方法制备含有不同浓度大蒜提取物的菌液后进行培养，分别于0、2、4、6、8、10、12 h取200 μL培养液加入96孔板中用酶标仪测定OD630 nm值，绘制成生长曲线。

1.4.4  对荧光假单胞菌生物膜形成的抑制作用

1）光学显微镜对生物膜的定性观察。按“1.4.2”方法制备含有不同浓度提取物的菌液，分装于锥形瓶中，将0.5 cm×0.5 cm的无菌输液管片置于锥形瓶内，28 ℃静置培养24 h后，弃培养液，添加新鲜LB培养基和提取物后继续静置培养24 h。取出输液管片，无菌水冲洗，干燥，染色。用光学显微镜观察（400×），拍照，具体参见文献[4]。

2）对生物膜的定量测定。参照文献[5]按1）方法操作，干燥、染色后输液管片用无水乙醇洗脱3 min， 取200 μL洗脱液加入96孔板中，酶标仪于570 nm测吸光度。按下式计算抑制率：

抑制率（%）=×100%

1.4.5  对胞外多糖产生的抑制作用  按文献[5]方法，P2培养至OD600 nm值约为0.4，分装至锥形瓶，加入不同浓度的提取物，28 ℃振荡培养24 h。取菌液4 000 r/min离心20 min，得上清液，取1 mL上清液至5 mL无菌离心管中，加入3倍体积的冷乙醇（AR），混合均匀后于4 ℃冰箱中静置24 h，12 000 r/min离心10 min，弃上清液，得沉淀，用2倍体积的无菌水稀释，用苯酚硫酸法测定胞外多糖[6]。

1.4.6  与防腐剂的协同作用  根据文献[7]，P2接种于新鲜LB培养基，培养至OD600 nm值约为0.4后，进行分组试验，对照组不加山梨酸钾，不加提取物;试验组一组加山梨酸钾，加提取物，另一组加山梨酸钾，不加提取物。每组加入等体积菌液，山梨酸钾最终浓度为10或5 mg/mL。大蒜提取物最终浓度为100 mg/mL。28 ℃静置培养24 h，酶标仪测定OD630 nm值，按2）中的公式计算抑制率。

2  结果与分析

2.1  对荧光假单胞菌的最小抑菌浓度（MIC）

对培养物生长情况进行观察，提取物浓度为400 mg/mL的培养管无菌生长，大蒜提取物对荧光假单胞菌的MIC为400 mg/mL。

2.2  对荧光假单胞菌生长的抑制作用

为进一步确定提取物在MIC浓度下对P2生长的抑制作用，对生长曲线进行了测定，并进行了显著性检验（图1）。提取物浓度为100、150 mg/mL时对P2的生长过程以及最大生长量均无抑制作用，而浓度为200 mg/mL时对P2的生长具有抑制作用，因此选100、150 mg/mL浓度进行下一步试验。

2.3  对荧光假单胞菌生物膜形成的抑制作用

结果如圖2所示，添加了大蒜提取物的生物膜与对照相比，细菌密度、团块体积均变小。提取物浓度增加，细菌密度、团块体积变小。定量测定结果表明，大蒜提取物浓度为100、150 mg/mL时对P2生物膜的抑制率分别为27.6%和38.7%（图3），抑制率随着提取物浓度的增大而增大。说明测试浓度的提取物在不影响P2生长的条件下，可以抑制P2生物膜的形成。

2.4  对胞外多糖产生的抑制作用

多糖是细菌被膜的主要成分之一[6，7]，所以可以通过测定胞外多糖的产生量进一步印证提取物对生物膜形成的影响。由图4可知，大蒜提取物浓度在100、150 mg/mL时对P2胞外多糖产生均有抑制作用，抑制率分别是4.5%和12.6%。由于多糖是生物膜的构成成分之一，所以同样浓度条件下大蒜提取物对多糖的抑制率远低于对生物膜的抑制率[8]。

2.5  与山梨酸钾的协同作用

由图5可知，山梨酸钾浓度为10或5 mg/mL时，添加100 mg/mL大蒜提取物后与不添加提取物相比，对P2生长的抑制作用均有所增强，说明大蒜提取物和山梨酸钾对P2的生长具有协同抑制作用。添加大蒜提取物可以增加P2对山梨酸钾的敏感性。

3  小结与讨论

本文研究了大蒜提取物对荧光假单胞菌P2生物膜形成的抑制作用。结果表明，大蒜提取物浓度在100、150 mg/mL时，对P2生长无抑制作用，但对其形成的生物膜的抑制率分别为27.6%和38.7%;对胞外多糖抑制率分别为4.5%和12.6%;大蒜提取物浓度为100 mg/mL时，与10、5 mg/mL的山梨酸钾均有协同作用。即提取物在非抑菌浓度下，对荧光假单胞菌生物膜的形成具有抑制作用，增强了荧光假单胞菌对防腐剂山梨酸钾的敏感性，有利于生物膜的破坏与清除，对生产上应用有非常重要的意义。该抑制作用可能是由于对荧光假单胞菌P2群体感应抑制所致，但其中的功能成分需进一步研究。

参考文献：

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[2] 黄讯辰，戴贤君.荧光假单胞菌生物膜的定性观察及影响因素研究[J].食品科技，2015，40（6）：14-18.

[3] 李婷婷，崔方超，马  艳，等.群体感应AHLs对温和气單胞菌体外致腐因子分泌的影响[J].食品与发酵工业，2017，43（3）：54-60.

[4] 丁荣荣，陈贵堂，杨志萍，等.大蒜提取物对铜绿假单胞菌生物膜形成的影响[J].食品与发酵工业，2017，43（2）：86-90.

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[6] 赵  丽.P.fluorenscens发酵生产胞外多糖的结构分析及活性评价[D].山东青岛：中国海洋大学，2013.

[7] 谢红梅，胡必杰，周昭彦，等.铜绿假单胞菌生物膜形成影响因素的研究[J].中华医院感染学杂志，2007，17（12）：1475-1501.

[8] PACKIAVATHY I A S V，AGILANDESWARI P，MUSTHAFA K S，et al. Antibiofilm and quorum sensing inhibitory potential of Cuminum cyminum and its secondary metabolite methyl eugenol against Gram negative bacterial pathogens[J].Food Res Int，2012，45：85-92.