刘泽文 袁芳艳 刘威 高婷 周丹娜 杨克礼 段正赢 郭锐 梁婉 田永祥

摘要：湖北省红安县某猪场新生仔猪发生一种以剧烈腹泻、排出黄色粪便并迅速脱水死亡为主要症状的疾病，经病原分离、革兰氏染色、PCR鉴定、生化试验和血清型鉴定，确定新生仔猪病是由大肠杆菌感染引起。经血清型鉴定，该分离菌株属于纤毛抗原987P型，该菌株对头孢曲松、头孢噻肟较敏感。

关键词：仔猪黄痢;大肠杆菌;分离鉴定

中图分类号：S828;S855.1         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2019）23-0142-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.23.034           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Isolation and identification of Escherichia coli from yellow diarrhea in piglets

LIU Ze-wen，YUAN Fang-yan，LIU Wei，GAO Ting，ZHOU Dan-na，YANG Ke-li，

DUAN Zheng-ying，GUO Rui，LIANG Wan，TIAN Yong-xiang

（Institute of Animal Husbandry and Veterinary，Hubei Academy of Agricultural Science/Key Laboratory of Prevention and Control Agents for Animal Bacteriocins，Ministry of Agriculture and Aural Affairs，Wuhan 430064，China）

Abstract： In a pig farm in Hong'an county， Hubei province， newborn piglets developed a disease characterized by severe diarrhea， discharge of yellow feces and rapid dehydration; after pathogen isolation， Gram staining， PCR identification， biochemical tests and serotype identification， E. coli infection in newborn piglets was determined. According to the serotype identification， the isolated strain belongs to the cilia antigen 987P type， and the strain is sensitive to ceftriaxone and cefotaxime.

Key words： piglet scutellaria; Escherichia coli; isolation and identification

2018年上半年，湖北红安县某猪场1～3日龄的新生仔猪出现拉黄色水样稀粪，内含凝乳小片，病仔猪消瘦、脱水，最后因衰竭而死亡。经过临床解剖、病原分离鉴定、生化鉴定确定为仔猪黄痢大肠杆菌感染。

1  材料与方法

培养基：麦康凯琼脂平板、改良Minca汤、糖发酵等培养基，按常规方法配制。

大肠杆菌标准菌株：大肠杆菌C83710菌株，由中国兽医药品监察所提供。

单因子血清：K88、K99、987P和F41纤毛单因子血清由农业农村部畜禽细菌病防治制剂创制重点实验室制备。

病料采集：采集湖北红安縣某发病猪场发病仔猪的黄色稀粪。

细菌的培养：将发病猪的黄色稀粪接种麦康凯琼脂平板，37 ℃培养16～20 h后，挑选单个红色菌落，再接种麦康凯琼脂培养基，37 ℃培养16～20 h后进行细菌鉴定。

细菌镜检：挑选麦康凯琼脂平板培养基上的单个菌落，经革兰氏染色，显微镜观察细菌形态。

细菌PCR鉴定：参照NY/T 2839-2015[1]合成PCR引物。

K88：K88-F  GATGAAAAAGACTCTGATTGCA

-841bp;K88-R  GATTGCTACGTTCAGCGGAGCG。

K99：K99-F  CTGAAAAAAACACTGCTAGCTA

TT-543bp;K99-R  CATATAAGTGACTAAGAAGGA

TGC。

987P：987P-F  GTTACTGCCAGTCTATGCCAA

GTG-463bp;987P-R  TCGGTGTACCTGCTGAACGA

ATAG。

F41：F41-F  GATGAAAAAGACTCTGATTGCA

-682bp;F41-R  TCTGAGGTCATCCCAATTGTGG。

扩增条件：94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s;52 ℃ 30 s;72 ℃ 1 min，30个循环;72 ℃ 10 min。

细菌纤毛抗原血清型鉴定：将PCR阳性菌株分别接种改良Minca汤培养基，37 ℃振荡培养8～10 h，分别取样与K88、K99、987P和F41纤毛单因子血清进行平板凝集试验，鉴定菌株的纤毛抗原型。

细菌生化试验：将PCR扩增呈阳性的大肠杆菌接种改良Minca汤，37 ℃振摇培养8～10 h，分别接种糖发酵和其他生化试验培养基小管，每管0.2 mL，37 ℃培养，观察结果。

细菌药敏试验：将分离纯化的菌株按常规方法进行药敏试验[2]。

2  结果与分析

2.1  形态、染色特性

临床发病仔猪病状见图1，分离菌株在麦康凯琼脂培养基上呈典型红色菌落（图2），改良Minca汤8～10 h培养物涂片，革兰氏染色，均为革兰氏阴性小杆菌（图3）。

2.2  PCR鉴定

分离菌株用987P引物扩增出阳性条带，K88、K99和F41引物均未扩增出条带（图4），鉴定该分离菌株纤毛抗原为987P型。

2.3  血清型鉴定

分离菌株改良Minca汤培养物与987P纤毛单因子血清进行平板凝集试验时出现凝集，而与K88、K99和F41纤毛单因子血清均未出现凝集现象，证明该分离菌株纤毛抗原为987P型。

2.4  生化鉴定

按常规方法进行生化鉴定，鉴定结果见表1。

2.5  药敏试验结果

对分离菌株进行药敏试验，结果（表2）表明，分离的大肠杆菌对头孢曲松、头孢噻肟较敏感，对头孢呋辛、卡那霉素和阿米卡星有一定敏感性，对其余药物表现为耐药。

3  小结与讨论

1）根据新生仔猪的临床发病症状、病原分离、革兰氏染色、PCR鉴定、生化鉴定和血清型鉴定结果，确定仔猪病是由仔猪大肠杆菌987P血清引起的新生仔猪大肠杆菌病（仔猪黄痢）。

2）新生仔猪大肠杆菌腹泻，即仔猪黄痢，是出生后几小时到1周龄仔猪的一种急性高度致死性肠道传染病，以剧烈腹泻、排出黄色或黄白色水样粪便以及迅速脱水死亡为特征。引起新生仔猪大肠杆菌腹泻的致病菌称为产肠毒素性大肠杆菌（ETEC），该菌利用菌毛黏附素，如F4（K88）、F5（K99）F6（987P）或F41吸附在新生仔猪小肠黏膜上，产生肠毒素，如STa（STI）、STb（STII）或LT，这些肠毒素致使仔猪小肠中的水分和电解质的量发生改变，引起仔猪发生腹泻[3]。

3）由于新生仔猪大肠杆菌感染仔猪日龄小，病程急，死亡快，一般发病后药物治疗效果不理想。母源性免疫是控制新生仔猪ETEC腹泻最有效的手段之一，通过对怀孕母猪接种疫苗，新生仔猪通过吸食初乳而获得免疫保护力。目前中国已研制成功了大肠桿菌（K88、K99、987P）和产气荚膜梭菌（C型）二联灭活疫苗[4]、新生仔猪大肠杆菌K88、K99双价基因工程菌苗以及仔猪大肠杆菌腹泻K88、K99、987P三价灭活疫苗等[5]，均具有较好的免疫效果。同时还应该加强饲养管理，改善母猪的饲料质量和搭配，母猪产房应保持清洁干净，仔猪尽早吃上初乳，保持仔猪生活环境较舒适的温度等。

参考文献：

[1] NY/T 2839-2015，致仔猪黄痢大肠杆菌分离鉴定技术[S].

[2] 倪语星，尚  红.临床微生物学与检验[M].第四版.北京：人民卫生出版社，2007.

[3] JEFFREY J，ZIMMERMAN，LOCKE A，et al.猪病学[M].第十版.赵德明，张仲秋，周向梅，等，译.北京：中国农业大学出版社，2014.

[4] 刘泽文，袁芳艳，刘  威，等.仔猪大肠杆菌病、C型产气荚膜梭菌病二联灭活疫苗的研制与应用[J].动物医学进展，2018，37（6）：24-28.

[5] 中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典[M].北京：中国农业出版社，2015.