卢琴 罗青平 张腾飞 罗玲 汪宏才 王红琳 温国元 张蓉蓉 张文婷 邵华斌

摘要：禽致病性大肠杆菌病（Avian Pathogenic Escherichia coli，APEC）是危害养禽业发展的主要细菌性病原之一，给养禽业的发展带来了严重危害。为研究APEC的致病性与耐药性之间的关系，从毒力基因的分布、生物膜的形成能力、耐药基因的分布等三个方面探讨了生物膜的形成能力与毒力基因、耐药基因在致病性中的作用，为后期研究禽大肠杆菌的致病机理及耐药机制等提供理论基础，并为开展禽大肠杆菌病的流行病学调查及监测、防控禽大肠杆菌病的流行提供理论数据。

关键词：禽致病性大肠杆菌病（Avian Pathogenic Escherichia coli，APEC）;生物膜;毒力基因;耐药基因;致病性

中图分类号：R378.2+1         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2019）23-0132-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.23.031           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Pathogenic effects of biofilm，virulence genes and drug resistance genes on APEC

LU Qin，LUO Qing-ping，ZHANG Teng-fei，LUO Ling，WANG Hong-cai，WANG Hong-lin，

WEN Guo-yuan，ZHANG Rong-rong，ZHANG Wen-ting，SHAO Hua-bin

（Institute of Animal Husbandry and Veterinary，Hubei Academy of Agricultural Scinences/Key Laboratory of Prevention and Control Agents for Animal Bacteriosis，Wuhan 430064，China）

Abstract： Avian Pathogenic Escherichia coli （APEC） is one of the major bacterial pathogens that endangers the development of the poultry industry， and has brought serious harm to the development of the poultry industry. In order to study the relationship between pathogenicity and drug resistance of APEC，the distribution of virulence genes， the biofilm formation ability and the distribution of drug resistance genes were discussed from three aspects，which were the distribution of virulence gene， the ability of biofilm formation and the distribution of drug resistance gene. The results provided a theoretical basis for the later study of the pathogenic mechanism and drug resistance mechanism of avian Escherichia coli， and carried out epidemiological investigation and surveillance of avian colibacillosis， and provided theoretical data for the prevention and control of avian Escherichia coli.

Key words： APEC; biofilm; virulence genes; drug resistance genes; pathogenicity

禽致病性大肠杆菌（Avian Pathogenic Escherichia coli，APEC）是引起鸡、火鸡及其他禽类局部或全身性大肠杆菌病的病原，病理表现为心包炎、肝周炎、腹膜炎、气囊炎、卵巢输卵管炎、滑膜炎和败血症等症状，是目前严重危害养禽业的传染病之一[1]。1885年德国小儿科医师Escherich自小儿粪便首次发现大肠杆菌;1894年，Ligniers首次报道了鸡大肠杆菌病，中國自1982年江苏省首次报道该病以来，目前几乎所有养禽区地均因感染禽致病性大肠杆菌造成不可忽视的经济损失[2]。

研究表明大肠杆菌的致病性与特定的血清型、噬菌体、耐酸碱能力、摄铁、生物膜的形成能力等有关，而致病性强的菌株由于在临床中耐药性提高，严重影响中国养殖业的可持续健康发展。而耐药性增强与生物膜的形成能力、毒力基因、耐药基因均具有相关性。

1  生物膜与APEC致病性的关系

细菌生物膜（Bacterial biofilms）又称为生物膜，是单细胞生物体粘附在固体表面聚集为一个群落，分泌多糖蛋白、纤维蛋白、脂质蛋白等，将自身包裹其中。细菌生物膜已经被证明在许多细菌中存在，包括大肠杆菌、猪链球菌、嗜血杆菌和鸭疫里默氏杆菌等[3]。Lewis[4，5]经过长期研究发现生物膜与细菌的耐药性相关，当细菌存在于生物膜内，对抗菌剂的抵抗能力显著增强。主动外排系统是指大肠杆菌细胞内膜存在的能量依懒性蛋白质外排泵，通过主动外排作用，可将药物从菌体内排出，使到达作用靶位点的药量减少，不足以发挥杀菌和抑菌作用。由主动外排系统介导，阻止药物在菌体内积聚是细菌产生多重耐药性的机制之一。OmpA参与合成外膜蛋白，与禽大肠杆菌的致病性有密切联系，上述研究结果与国内外对APEC的毒力基因检测结果一致[6，7]。大肠杆菌的外膜对许多抗生素的通透性较低，形成屏障，阻碍抗菌药物进入菌体细胞内发挥抗菌作用。大肠杆菌外膜上存在的多种外膜蛋白质，对大多数疏水性药物具有良好的通透性。生物膜阳性菌株的致病力强于生物膜阴性菌株，这为临床预防仔猪腹泻病提供了理论依据[8]。生物膜是威胁人类健康的杀手之一，根据CDC统计人类约65%的细菌感染性疾病与生物膜形成有关，也有研究认为约80%的细菌性疾病与生物膜有关[9，10]。细菌一旦形成生物膜，其耐药性可增强100～1 000倍，能够抵抗机体免疫力和抗生素的侵害引起反复感染，大肠杆菌能在口腔、尿道、生殖道、肠道形成生物膜导致反复感染[11-13]。

2  毒力基因与APEC致病性的关系

大肠杆菌的致病性与毒力基因的关系已成为国内外研究热点。Germon[14]、Huang[15]研究ibeA基因对APEC的毒力作用，结果证明，敲除APEC-BEN2908菌株中的ibeA基因能导致毒力明显下降。Kmet等[16]研究白嘴鸦大肠杆菌的致病性和耐药性，结果表明与致病性相关的毒力因子为iutA、cvaC、iss、tsh、ibeA基因，内酰胺类耐药基因主要为CTX-M、CMY，喹诺酮类耐药基因为qnrS、integrase1等，对氨苄西林、链霉素、环丙沙星呈现不同程度的耐药。Mohamed等[17]对肉鸡大肠杆菌的毒力因子和耐药性关系研究，得出其主要的毒力因子为tsh、papC、colV和iss基因，96%的试验菌株对诺氟沙星高度耐药。Maud等[18]研究表明ibeA能增加大肠杆菌对H2O2的抵抗力，能部分解释ibeA在致病性菌株毒力的作用。喻华英等[19]证实细菌粘附结构fimH基因和fliC基因是影响大肠杆菌形成生物膜的主要粘附结构毒力基因，其次是大肠杆菌毒力因子KpsMTII基因，最后是外膜蛋白血红素chuA基因。95%的大肠杆菌分离株可表达I型菌毛。fimH基因（Type 1 fimbria）为编码1型菌毛粘附素基因，其作用为大肠杆菌菌毛介导结合受体结构，使细菌侵入各种宿主组织[20，21]。FliC是编码鞭毛丝结构蛋白基因，是鞭毛组成的基本亚基，能形成大肠杆菌的鞭毛结构[22]。高清清[23]、Gao等[24]对SPF鸡致病试验表明，介导沙门菌素摄铁的iroD基因和编码气杆菌素合成的iucD基因与APEC和UPEC致病性有较强的相关性。Lise等[25]证明敲除掉mliC基因后APEC菌株的毒力下降。iss基因存在于ColV质粒上，其编码的蛋白iss属于外膜蛋白的一部分，与细菌抗补体作用有关，可增强大肠杆菌血清抗性[26，27]。iss在APEC中的检测率更高，其可能是APEC的一个重要致病因子[28，29]，促使APEC能够在宿主体内迅速增殖。

3  耐药基因与APEC致病性的关系

对于大肠杆菌病的治疗，一般采用β-内酰胺类、喹诺酮类、四环素类及磺胺类药物，故本研究以β-内酰胺类、喹诺酮类、四环素类及磺胺类药物的主要耐药基因（β-内酰胺类TEM、CTX-M，四环素类tetA、tetB，喹诺酮类gyrA、gyrB，磺胺类sul1、sul2）进行研究，探讨APEC毒力因子的致病作用是否与耐药基因所占比重相关。武瑞兵等[30]根据耐药表型检测了耐四环素菌中tetA、tetB和tetC基因，结果表明tetA基因是所有四环素耐药基因中最为流行的一种基因（占55%）;耐磺胺类药菌中sul1、sul2和sul3基因中sul2基因在耐磺胺异恶唑菌中的检出率最高（占77%）;β-内酰胺类药物耐药基因中最流行的为TEM1基因（占73%）。四环素耐药性主要由tetA和tetB基因编码，这一发现已经在分离自畜牧业生产和食用动物的大肠杆菌中被证实[31]。张扬等[32]的研究表明tetA和tetB基因也几乎均匀地分布于15个ERIC型菌株中，说明tetA和tetB基因在菌株间主要是水平传播。肺炎克雷伯菌对喹诺酮类耐药与多种基因突变相关，最主要的是gyrA基因突变[33]。目前已发现的喹诺酮类抗生素的耐药基因主要包括gyrA、gyrB、qnrA1、qnrB、qnrS1、qeqA和aac（6，）Ib-Cr等[34-36]。有研究表明，动物源性磺胺类耐药基因sulR（sul1、sul2、sul3）很有可能转移到人的共生菌大肠杆菌中，并引起泌尿道感染[37]。有研究表明sul1与Ⅰ型整合子高度相关，近年来Ⅰ型整合子的检出率不断上升，整合子在细菌间的转移又十分频繁和广泛，不仅可以在同种细菌间转移，还在不同种细菌间转移，sul1则通过整合子在菌群间传播[38]。sul2主要位于质粒上，质粒作为可移动元件在细菌间转移也十分频繁，sul2随着质粒的转移而向外传播。有研究表明sul1和sul2在磺胺类耐药菌株的产生中起重要作用[39-41]。细菌对β-内酰胺类抗生素产生耐药性主要机理是其产生β-内酰胺酶和超广谱β-内酰胺酶（Extended-spectrum β-lactamases，ESBLs）编码ESBLs的基因位于细菌携带的质粒上，常参与细菌的多重耐药。现已发现的ESBLs基因主要包括TEM、SHV、CTX-M、OXA和其他型等[42]。Paterson等[43]的研究表明有75株受试菌种有57株扩增出TEM型基因，29株扩增出CTX-M型基因。中国已报道的基因型包括CTX-M-14、CTX-M-64、TEM-1型和SHV-2等，不同基因亚型菌株间的耐药性差异及耐药基因传播机制等还需进一步研究[44，45]。

在后期的试验中可结合特定的血清型、毒力基因的类型、铁离子摄取系统、噬菌体、生物膜的形成能力、动物试验和耐药基因及药敏试验等去探讨致病耐药性增强与特定的血清型有没有相关性，毒力基因的分布及研究中的哪种毒力基因在致病耐药性中占主导作用，为全面阐明APEC毒力基因的致病机理和耐药机制提供理论基础。

参考文献：

[1] EWERS C，JANSSEN T，WIELER LH，et al. Avian pathogenic Escherichia coli（APEC）[J].Berliner und münchener tierrztliche wochenschrift，2003，116（9/10）：381-395.

[2] 馬兴树.禽传染病实验诊断技术[M].北京：中国化工出版社，2006.

[3] HU Q H，HAN X G，ZHOU X J，et al. Characterization of biofilm formation by Riemerella anatipestifer[J].Veterinary microbiology，2010，144（3/4）：429-436.

[4] LEWIS K. Riddle of biofilm resistance[J].Antimicrobial agents and chemotherapy，2001，45（4）：999-1007.

[5] LEWIS K. Persister cells and the riddle of biofilm survival[J].Biochemistry （Moscow），2005，70（2）：267-274.

[6] JAN？茁EN T，SCHWARZ C，PREIKSCHAT P，et al. Virulence-associated genes in avian pathogenic Escherichia coli （APEC） isolated from internal organs of poultry having died from coli bacillosis[J].International journal of medical microbiology，2001，291（5）：371-378.

[7] 陈文静，韩先干，何  亮，等.鸭致病性大肠杆菌的分离鉴定及其生物学特性分析[J].中国动物传染病学报，2010，18（2）：34-40.

[8] 喻华英，陈绪松，贾桂珍，等.仔猪腹泻的大肠杆菌生物膜的筛选和致病力观察[J].中国兽医学报，2015，35（5）：824-827.

[9] 汤景元，王红宁，张鹏举，等.95个猪场大肠杆菌耐药表型及氨基糖苷类药物耐药基因型调查[J].畜牧兽医学报，2008，39（4）：472-477.

[10] 李冬梅，赵秀媛.细菌生物膜在临床中的研究进展[J].实用医技杂志，2007，14（16）：2251-2253.

[11] STEWART P S，COSTERTON J W. Antibiotic resistance in biofilms[J].Lmct U，2001（358）：135-138.

[12] COSTERTON J W，STEWARTLO S. Battling biofilms[J].Science，2001，281（1）：74-81.

[13] SEHAIK W，ABBE T. The role of σB in the stress response of Gram-positive bacteria-targets for food preservation and safety[J].Curr Op in Biotechnol，2005，1（8）：18-24.

[14] GERMON P. ibeA，a virulence factor of avian pathogenic Escherichia coli[J].Microbiology，2005，151：1179-1186.

[15] HUANG S H. Escherichia coli invasion of brain microvascular endothelial cells in vitro and in vivo：Molecular cloning and characterization of invasion gene ibe10. Infect[J].Immun，1995， 63：4470-4475.

[16] KMET V，DRUGDOVA Z，KMETOVA M，et al.Virulence and antibiotic resistance of Escherichia coli isolated from rooks[J].Annals of agricultural and environmental medicine，2013，20（2）：273-275.

[17] MOHAMED M A，SHEHATA M A，ELSHIMAA RAFEEK. Virulence genes content and antimicrobial resistance in Escherichia coli from broiler chickens[J].Veterinary medicine international，2014，2014：1-6.

[18] MAUD Fléchard，Mélanie A M，MARYLINE R，et al. New role for the ibeA gene in H2O2 stress resistance of Escherichia coli[J].Journal of bacteriology，2012，194（7）：4550-4560.

[19] 喻华英，张亮亮.大肠杆菌生物膜毒力基因的检测[J].中国农学通报，2014，30（8）：17-22.

[20] SHI Q M，ZHANG Y Y，GAO G S. PCR detection of virulence genes Colv，Stxs and HlyE of Escherichia coli[J].Agricultural science &technology，2012，13（10）：2044-2047.

[21] 何素芬.禽致病性大腸杆菌I型菌毛fimH基因缺失突变株的构建及部分生物学特性的分析[J].微生物学报，2008，48（2）：252-256.

[22] 尹晓琳，石新丽，马翠卿，等.尿路致病性大肠杆菌I型菌毛fimH和fimC基因原核表达质粒的构建及表达[J].中国人兽共患病学报，2007，23（11）：136-138.

[23] 高清清.禽病原性大肠杆菌与尿道致病性大肠杆菌相关铁摄取系统与调控蛋白RfaH及荚膜致病作用的研究[D].江苏扬州：扬州大学，2013.

[24] GAO Q Q，WANG X B，XU H Q，et al. Roles of iron acquisition systems in virulence of extraintestinal pathogenic Escherichia coli：salmochelin and aerobactin contribute more to virulence than heme in a chicken infection model[J].BMC microbiology，2012，12（143）：1471-218.

[25] LISE V，ELLEN O，JORIS M，et al. Role of lysozyme inhibitors in the virulence of avian pathogenic Escherichia coli[J].PLoS ONE，2012，7（9）：e45954-45961.

[26] JOHNSON T J，GIDDINGS C W，HOME S M，et al. Location of increased serum survival gene and selected virulence traits on a conjugative R plasmid in an avian Escherichia coli isolate[J].Avian Dis，2002，46：342-352.

[27] NOLAN L K，GIDDINGS C W，HOME S M，et al. Complement resistance，as determined by viable count and flow cytometric methods，and its association with the presence of iss and the virulence of avian Escherichia coli[J].Avian Dis，2002，46：386-392.

[28] VIDOTTO M C，MULLER E E，DE FREITAS J C，et al. Virulence factors of avian Escherichia coli[J].Avian Dis，1990，34：531-538.

[29] CHRISTA E，TRAUTE J，SABINE K，Molecular epidemiology of avian pathogenic Escherichia coli（APEC） isolated from colisepticemia in poultry[J].Veterinary microbiology，2004，104（1-2）：91-101.

[30] 武瑞兵，高玉敏，王鹏翔，等.牛肉源大肠杆菌的耐药性检测及相关耐药基因分布[J].中国畜牧兽医，2015，42（2）：452-458.

[31] GUERRA B，JUNKER E，SCHROETER A，et al. Phenotypic and genotypic characterization of antimicrobial resistance in German Escherichia coli isolates from cattle swine and poultry[J].Journal Antimicrob chemother，2003，52（3）：489-492.

[32] 张  扬，陈丽鹏，吴  华，等.鸡源大肠杆菌四环素耐药基因检测[J].江西农业学报，2014，26（1）：94-96.

[33] 刘鲜花，罗史科，金  娴，等.肺炎克雷伯菌对喹诺酮类耐药基因检测及耐药机制分析[J].海南医学院学报，2015，21（4）：453-455.

[34] 戴  丽.喹诺酮类药物临床应用及不良反应[J].中华医院感染学，2012，22（1）：163-164.

[35] 陶秋贤，曹  青.喹诺酮类药物在临床应用中的不良反应统计分析[J].成都医学院学报，2011，6（4）：354-355.

[36] 姜梅杰，包  健，孙树玲，等.肺炎克雷伯菌质粒介导的喹诺酮类耐药基因的研究[J].中华实验和临床感染病杂志（电子版），2012，6（6）：594-597.

[37] MARGARITA T， JAKOBSEN L， OLSEN K， et al. Prevalence of sulphonamide resistance and class Ⅰintegron genes in Escherichia coli isolates obtained from broilers， broiler meat，healthy humans and urinary infections in Denmark[J].International journal of antimicrobial agents，2008，32（4）：367-369.

[38] BYRNE-BAILEY K G，GAZE W H，ZHANG L，et al. Integron prevalence and diversity in manured soil[J].Applied and environmental microbiology，2011，77（2）：684-687.

[39] 韦庆兰，张济培，谭华龙，等.广东地区水禽源大肠杆菌耐药性和磺胺类耐药基因检测[J].中国家禽，2015，37（3）：54-56.

[40] 宁家宝，陈建红，张济培，等.鸡白痢沙门菌的耐药性及磺胺类耐药基因的研究[J].中国家禽，2014，36（3）：18-20.

[41] PERRETEN V，BOERLIN P. A new sulfonamide resistance gene（sul3）in Escherichia coli is widespread in the pig population of Switzerland[J].Antimicrob agents chemothery，2003，47（3）：1169-1172.

[42] CHAMPS D C，CHANAL C，BONNET R，et al. A 1998 survey of extended β-spectrum β-lactamases in Enterobacteriaceae in France[J].Antimicrobial agents and chemotherapy，2000，44（11）：3177-3179.

[43] PATERSON D L，BONOMO R A.Extended-spectrum beta-lactamases：A clinical update[J].Clin Microbiol Rev，2005，18（4）：657-686.

[44] 鐘钦卿.四川省动物源大肠杆菌质粒介导ESBLs和AmpC酶耐药基因的检测[D].成都：四川农业大学，2012.

[45] 苑  丽，刘建华，胡功政，等.鸡大肠杆菌tem和ctx-M型超广谱β-内酰胺酶基因分型研究[J].中国农业科学，2010，20（24）： 1-7.