陈 婷 王怡坤 俞如旺

(福建师范大学生命科学学院 福州 350117)

“分解纤维素的微生物的分离”是人教版高中教材选修1中的一个实验，包括土壤取样、选择性培养纤维素分解菌、菌悬液的浓度梯度稀释、涂布平板法分离细菌、纤维素分解菌的观察与鉴定等步骤。本文对该实验的操作步骤进行一些细节补充，能够有效地提高该实验的成功率，激发学生的学习兴趣，提高学生对微生物的分离、培养与鉴别能力。

1 土壤取样

收集富有纤维素分解菌的土壤样品，应选择纤维素丰富的土质。如花盆土、多年积累的枯枝败叶、腐殖土等[1]。具体操作： 在校园中选择落叶丰富的区域，拨开树叶，用小铲取叶下腐殖质丰富的土壤。在报纸上将土壤碾碎，并用镊子取出土壤中较大的沙石、树叶、树根、虫卵等物质，将剩余土壤放入无菌袋中备用。需注意的是： 选取土壤样本时切勿选用过于疏松，含大量树叶、树根的土壤。因为，此类土壤在摇床培养时会出现大量碎屑，影响菌悬液浓度梯度稀释过程中的菌液采集。

如若校园中无法找到合适的、富有纤维素的土壤，也可以将滤纸埋在约10cm深的土壤处，一段时间后即可获得具有分解纤维素能力的大量微生物。人教版高中教材选修1中提及： 将滤纸埋在土壤中，30d左右能够从滤纸中获取大量纤维素分解菌。但笔者利用校园环境，将滤纸埋在夏季温暖、湿润的校园花园中，仅需7d左右便可从滤纸上获取大量纤维素分解菌。

2 选择性培养纤维素分解菌

利用纤维素分解菌的选择性培养基，可使土壤混合菌落中的纤维素分解菌成为优势种群，从而在液体培养基中大量富集。具体操作： 按照纤维素分解菌的选择培养基配方配置30mL的培养基倒入锥形瓶中，封口后在121℃下高压蒸汽灭菌20min。在无菌环境下，称取6～10g土壤于选择性培养基中，置于30℃、250rpm的摇床培养1d左右至培养基变混浊，取上层悬液备用。

但笔者经反复实验得出，忽略选择性培养纤维素分解菌这一步骤，直接将土壤溶于生理盐水中，制备菌原液能够获得更好的实验效果。其原因有二： ①选择性培养纤维素分解菌的过程易受培养时间、温度等因素影响；②过度培养土壤悬液中的各种细菌，会导致选择性培养基中菌量过大，反而造成培养基中含氧量降低、营养物质减少等结果，最终影响土壤中纤维素分解菌的菌种丰富度。

因此，若忽略选择性培养纤维素分解菌后，将土壤溶解于生理盐水中，可制备土壤样品在生理盐水中的菌悬液。具体操作： 将6g土壤样品加入30mL生理盐水中，置于30℃、 250rpm的摇床上，振荡培养0.5～1h左右，取上层悬液备用。该操作能够使土壤中的各种微生物充分溶于生理盐水，提取出较为原始的土壤菌群。

3 菌悬液的浓度梯度稀释

选择性培养基制备的菌悬液中菌浓度极高，若以其作为母液，直接接种于鉴别性培养基上，会导致鉴别性培养基中菌的分布过于密集，从而出现菌落重叠的现象，不利于后续的观察。因此，在实际操作中应以选择性培养基中的菌液或生理盐水中的菌液作为菌原液，进行密度梯度稀释。该操作可以有效降低培养基中的菌数，便于培养出单菌落，从而进行后续的实验。具体操作： 取一支试管，加入9mL生理盐水和1mL菌悬液并摇匀，制成浓度为10-1菌悬液；在浓度为10-1菌悬液中取1mL悬液加入另一支装有9mL生理盐水的试管中并摇匀，制成浓度为10-2菌悬液。按照上述操作，可依次制备出10-1～10-6浓度梯度的菌悬液。富集培养后的菌悬液一般需要将浓度稀释至10-2～10-4，才能容易将菌落分散开，出现清晰的单一菌落；而未富集培养的菌悬液一般是将菌悬液浓度稀释至10-2～10-3最为适宜。

值得注意的是，笔者在实验操作中两次以无菌生理盐水取代教材中提及的无菌水，进行土壤样品溶解、制备菌原液及菌悬液的浓度梯度稀释等步骤。原因在于： 生理盐水不仅是人体细胞的等渗液，也是细菌细胞的等渗液，能够维持细菌的形态、结构，使其保持生命活性。并且生理盐水能够为细菌细胞的生命活动提供所需的无机盐，有利于细菌生长。

4 涂布平板法分离菌株

采用涂布平板法将稀释后的菌悬液接种至鉴别培养基中，能够使悬液中的菌均匀地分散在培养基上，便于对纤维素分解菌的观察、鉴别、计数与挑选。具体操作： 将制备好的菌悬液摇匀后，选择浓度适宜的菌悬液进行涂布平板。在无菌条件下，用移液枪取0.1mL菌悬液至琼脂固体培养基中，并用涂布棒将菌液均匀地涂布在培养基上，室温放置2～3min，使菌液完全被培养基吸收。用封口膜封口，将培养基倒置在30℃左右的恒温箱中培养1～2d即可。培养基倒置培养，可以防止在培养菌的过程中产生的水滴落到培养基上，冲散菌落。

若条件允许，可在接菌前，预先倒好培养基，待培养基凝固后，将其倒扣并置于32℃左右的恒温箱中烘干2～3h。该做法能有效减少培养基中的水分，使菌液更快被培养基吸收，避免培养基染菌或出现水痕。

5 纤维素分解菌的观察与鉴定

快速鉴别纤维素分解菌的方法有很多，其中刚果红染色法是目前比较常用的一种鉴别的方法[2]。刚果红能够与纤维素形成红色复合物，因此可用其鉴定纤维素或纤维素分解菌。将刚果红加入固体培养基中，刚果红与培养基中的纤维素形成红色复合物，因此培养基呈现红色；含有纤维素分解菌的菌落，由于纤维素分解菌分解其周围纤维素，因此其周围的纤维素含量较低或无纤维素的存在，则菌落周围无红色复合物形成，因而出现以菌落为中心的透明圈。其中，常用的刚果红染色法有两种，具体操作如下：

方法一： 将适量的刚果红加入尚未凝固的培养基中，充分溶解，可配置出纤维素分解菌的鉴别性培养基。再进行菌落接种的培养，从而观察单一菌落周围培养基的情况。为使纤维素分解菌周围的透明圈更易观察，须将培养基置于白色背景，如白色硬纸板前；并适当地调节观察角度，可明显观察到部分菌落周围存在透明圈。调节刚果红的浓度，使其在培养基中的浓度适当，能更容易观察到透明圈。经笔者反复实验、比较得出，当刚果红在培养基中的浓度约为0.3g/L时，培养基既能保持一定透明度，又能和透明圈出现明显色差。

方法二： 先在固体培养基中培养菌群，待菌落长出，加入适量1mol/L的刚果红溶液染色，等待15min后倒去培养皿内的刚果红与浮起的菌落。再加入适量1mol/L的NaCl溶液漂洗一次，洗去浮色。

比较两种方法，以方法一进行纤维素分解菌的观察与鉴定能更容易观察到菌落的实际大小、形态。以方法二进行纤维素分解菌的观察与鉴定虽然可以在培养基上观察到较为明显的透明圈，但形态结构较为光滑的细菌染色、漂洗过程中容易浮起并被带走，因此不利于菌落的形态的观察，难以保留菌种。

(基金项目： 教育部人文社会科学研究规划基金项目“核心素养导向的科学课程高中学业水平考试实施策略与命题研究”，No.17YJA880088;*通信作者)