吴涛 张慧贤 张方州 郑中兵

摘 要 以人心果果实为研究材料，以水、甲醇、70%乙醇、乙酸乙酯和石油醚共计5种溶剂对人心果果实部位进行提取，对5种提取剂提取的样液分别进行DPPH自由基清除活性、铁离子还原能力（FRAP）、ABTS自由基清除活性及总黄酮含量进行测定。结果表明，使用不同溶剂的人心果提取样液测定结果中存有一定的差别，样液抗氧化活性由高到低的排序为：70%乙醇>乙酸乙酯>甲醇>水>石油醚;此外，研究结果显示，人心果的抗氧化活性与总黄酮含量存在较好的相关性。

关键词 人心果;提取剂;总黄酮;抗氧化活性

中图分类号：S667.9 文献标志码：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2019.27.066

人心果（Manilkara zapota）是山榄科人心果属[1]，原产地在美洲热带，后又引种到印度和东南亚等地，我国人心果是由华侨从东南亚引种而来[2-3]。果树属于常绿乔木，具有白色乳汁，因其树形美姿常用于观赏领域;果实为浆果，成熟时呈灰褐色或锈褐色，果肉呈现黄褐色透明状，果皮和果肉不易分离，有核[4-5]。人心果中含有大量的有益物质，何钢等[6]发现人心果乳汁中具有多种对人体有益的化学成分，可进一步开发，作为多应用领域的植物。李安平等[7]发现人心果对于·OH、ABTS+、DPPH·的清除作用较好。张秀梅等[8]在人心果叶的研究中发现其抗氧化能力较好。马飞跃等[9]在研究人心果叶片时发现，叶片中含有较高的抗氧化成分，同时采用多种方法测定人心果叶片抗氧化活性，发现结果存在差别。在实验室测定水果抗氧化能力时，提取剂的选择较为单一，类似研究也较为少见。然而想要全面客观地反映某种水果的抗氧化活性必须设定在不同的反应条件中进行比较[10]，溶解水果成分的提取剂环境便是一个重要影响因素。

由于近年对人心果果实的研究相对较少，因此本研究选择营养价值较高的热带名优水果——人心果。研究选取了甲醇、70%乙醇、水、乙酸乙酯和石油醚这5种较为常见的溶剂对人心果进行提取，并通过DPPH法、FRAP法、ABTS法分析样液的抗氧化能力。3种抗氧化测定方法在国内食品抗氧化能力测定中很常见，且比较方便。此外，研究测定了人心果的总黄酮含量，并分析了其与抗氧化能力之间的相关性。

1 材料

1.1 实验材料

人心果购自海口南北水果市场，经检查确定新鲜且无病虫害。

1.2 试剂

甲醇、乙醇、氢氧化钠、亚硝酸钠、水溶性维生素E（Trolox）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）、2，4，6-三（2-吡啶基）三嗪（TPTZ）、Folin-Ciocalteu、芦丁。

1.3 仪器

KF10920单道可调移液枪、KD12283单道可调移液枪、AS220.R1万分之一电子分析天平、粉碎机、T6新世纪紫外可见分光光度计、DHG-9053A干燥箱、HH-4A数显恒温水浴锅、DW100实验室超纯水机、KQ5200E型超声波清洗机、TGL-16S台式高速冷冻离心机。

2 方法

2.1 样液的提取

2.1.1 样品的制备

将人心果洗净后去皮切成片，放置在烘干箱中烘干，温度为70 ℃，烘干时间约4 d。期间要保证烘干箱保持该状态，切忌断电。4 d后用粉碎机粉碎5 min，若仍存在颗粒大的样品，可增加时长，或者用研钵将大颗粒研磨成粉末状，在室温下用保鲜袋保存。

2.1.2 称量

使用分析天平称取3组0.100 0 g样品，并置于5 mL离心管中，标记序号。

2.1.3 样液制备

使用无水乙醇配制70%乙醇，用移液枪吸取4 mL，加入离心管并充分振荡。为了使水果的溶解更加充分彻底，将样品进行超声处理。超声处理结束后将离心管擦拭干后离心，离心前要对每组进行称量配平，达到每组盛有样液的离心管质量一致的标准。配平后放入离心机，35 ℃条件下，5 000 r·min-1离心7 min。离心结束后，小心取出离心管，避免振荡，将每个离心管上清液取出，按顺序置于相应的10 mL离心管中。为了使样品提取更加充分，向已提取上清液的5 mL离心管中加入3 mL70%乙醇，充分振荡每个离心管后，进行第2次超声离心，离心后合并两次上清液并冷藏保存。用等体积蒸馏水、甲醇、乙酸乙酯和石油醚代替70%乙醇溶液按照同样的操作步骤进行样液制备。

2.2 DPPH自由基清除能力测定

依据Thaipong等[11]的方法，以Trolox作為标准样品，做适当改进。取重量为0.062 6 g的Trolox标准品，使用70%乙醇溶液定容至25 mL，配制成浓度为10 mmol·L-1的Trolox乙醇溶液作为该实验的母液。将母液按照表1进行浓度稀释并编号。将标准溶液与2 mLDPPH甲醇溶液混合，充分摇匀后置入暗箱中，20 min后于517 nm处测量吸光值，用蒸馏水作对照，得到标准曲线（y=-7 978x+2 738.7，R?=0.975 3）。

取25 μL样品提取液，按照以上步骤反应，于同等条件下测定不同提取液的DPPH自由基清除能力（mmol·L-1Trolox·g-1DW），其含义为1 g测定测定物质中等量于Trolox的抗氧化活性。

2.3 FRAP法测定抗氧化能力

按照“2.2”配制Trolox母液并稀释编号。取1 mL蒸馏水与10 μL标准溶液混合稀释，摇匀后在体系中加入1.8 mL TPTZ溶液，混匀后在37 ℃反应10 min后于593 nm处测量吸光光度值，结果如表2所示，用蒸馏水作对照，得到标准曲线（y=5 043x-457.59，R?=0.989 7）。

取10 μL样品提取液，按照以上步骤反应，在相同条件下测定3个提取液的铁离子还原能力（mmol·L-1Trolox·g-1DW），其含义为1 g测定物质中等量于Trolox的抗氧化活性。

2.4 ABTS自由基清除能力测定

依据于靖[12]的方法，配制Trolox母液并稀释编号。取5 mLABTS溶液（7 mmol·L-1）和88 μL K2S2O8水溶液（140 mmol·L-1），避光反应12 h后于732 nm处测量吸光光度值，结果如表3所示，用蒸馏水作对照，得到标准曲线（y=-4 730.9x+3 210.4，R?=0.988 8）。

取25 μL样品提取液，按照以上步骤反应，于同等条件下测定3个提取液的ABTS自由基清除能力（mmol·L-1Trolox·g-1DW），其含义为1 g测定物质中等量于Trolox的抗氧化活性。

2.5 总黄酮测定

参照李洪芹[13]的总黄酮提取方法并加以改进，按照下表配制不同浓度芦丁。取1 mL芦丁溶液与0.15 mL的5% NaNO2混合，反应6 min;反应结束后继续加入0.15 mL的10% AlCl3，反应6 min;再向體系中加入2 mL 4% NaOH及5 mL蒸馏水，反应15 min。在420 nm处测定吸光值，结果如表4所示，得到标准曲线（y=0.920 3x-0.000 1，R2=0.998 7）。

取1 mL样液，按照以上步骤反应，于同等条件下测定3个提取液中的总黄酮含量，结果以芦丁等价值g/100 g-1表示。

2.6 数据分析方法

采用IBM SPSS Statistics V21.0软件进行数据分析，显著性水平为0.05。

3 结果与分析

3.1 DPPH自由基清除能力

如图1所示，人心果果实样提取液具有一定的DPPH自由基清除能力，不同组别存在一定的差异。在清除能力上，乙酸乙酯提取液的抗氧化活性强度高于其余4种，水、石油醚、70%乙醇提取液测得的结果活性强度一般，甲醇测得的人心果抗氧化活性强度最差。

3.2 还原抗氧化能力（FRAP）

如图2所示，在人心果的FRAP法测定抗氧化能力测定中，5种提取物均显示出一定的还原能力，不同组别存在一定差异，提取剂分别为70%乙醇和甲醇的两组还原抗氧化能力大致相同，明显高于其他组，而提取剂为石油醚、乙酸乙酯时，还原抗氧化能力最弱。

3.3 ABTS自由基清除能力

图3为ABTS法测定人心果样液清除ABTS自由基的结果。不同组别存在一定差异，选用70%乙醇测得的活性强度最高，其次为水和甲醇，石油醚和乙酸乙酯的活性强度最弱。

3.4 总黄酮含量测定

从图4可知，在人心果的总黄酮含量测定中，不同组别测定的含量存在一定差别。乙酸乙酯组测定的结果明显较高，甲醇及70%乙醇的总黄酮含量一般且基本相同，含量最低的是石油醚和水。

3.5 相关性分析

通过表5可知，在0.05水平（单侧）上，ABTS自由基清除法与FRAP法测得抗氧化活性强度呈显著相关，使用DPPH法测得的活性强度结果与总黄酮含量相关。

3.6 Topsis综合分析

为进一步综合研究比较各种提取剂对人心果测定结果的影响，研究对测定的结果采用了Topsis综合分析。

从表6中可得知，经过综合分析比较，这5种溶剂中用70%乙醇提取人心果抗氧化活性物质效果最佳，其次是乙酸乙酯、甲醇和水，石油醚效果最差。

4 结论与讨论

近年来，抗氧化活性研究在不同溶剂提取某种物质的相关研究中较为常见，牛德芳等[14]对油菜蜂花粉、蜂粮的水和醇提取物研究中发现，利用醇提取的蜂花粉和蜂粮测定结果比水好。赵玉红等[15]用多种溶液对蔷薇叶花青素、总黄酮、总酚进行提取并测定抗氧化活性，发现60%乙醇提取物的含量较高。田强等[16]对厚朴籽不同溶剂的萃取物进行比较分析，得到的结论是乙酸乙酯提取效果最好，与本实验中通过Topsis分析后发现乙酸乙酯组的活性较强的结论类似。如果需要全面、科学地评价研究对象的抗氧化能力，应采用更合理科学的抗氧化活性测定方法进行测定，如ORAC法。ORAC法测量总体抗氧化能力，可以客观地反映出即刻脂质过氧化程度[17]。

通过结果分析可知，提取剂的不同会影响到人心果抗氧化活性的测定结果，在这5种提取剂中，乙酸乙酯最适合用于DPPH法对人心果的测定，70%乙醇、甲醇适合用于FRAP法对人心果的测定，70%乙醇适合用于ABTS法对人心果的测定。通过综合分析之后，70%乙醇是较适合人心果的提取剂。此外，从结果分析中可以知道DPPH法结果与总黄酮含量在0.05水平（单侧）上相关，人心果的抗氧化能力与总黄酮含量也存在良好的相关性。

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（责任编辑：赵中正）