雷 煜，张振楠，胡 广，刘建芬，唐 叶，张 宁，司怀军，吴家和

(1.甘肃农业大学 生命科学技术学院，甘肃 兰州 730070；2.中国科学院 微生物研究所，北京 100101； 3.棉花生物学国家重点实验室，郑州大学基地，河南 郑州 450001)

植物不能够像动物那样趋利避害的自由移动，因此，当病原菌浸染时，其只能通过调节自身的生理生化反应来抵抗或适应这些变化，这些变化被称为植物先天免疫反应。一般认为植物的先天免疫反应包括2个层次或进程，一个是由病原菌相关分子模式(PAMP)启动的先天免疫反应，称为PTI，另一个是由病原菌效应因子(Effector)启动的先天免疫反应，称之为ETI[1-2]。当植物先天免疫反应时细胞内的抗病相关基因表达发生了改变(Reprogram)，而这些抗病相关基因主要是受编码调控蛋白和转录因子调控的，其中转录因子主要包括WKRY、MYB、NAC、bZIP等[3]。

WRKY转录因子是植物中最大转录因子家族之一，在拟南芥中有72个WRKY转录因子[4]，棉花中报道的为116个[5]。WRKY蛋白一般被分为3个组群，分别为GroupⅠ、Ⅱ、Ⅲ，其中Group Ⅱ又被分为5个亚组，被标为Ⅱa、b、c、d和e。WRKY蛋白含有WRKYGQK保守结构域，其C端含有C2H2或C2C2的锌指结构[5-6]。WRKY转录因子通常作为植物信号网络中的重要组成因子，在植物体内承担着多种功能，包括植株的生长发育和逆境响应。其中对病原菌抗性反应研究涉及多个WRKY转录因子，如在拟南芥中，WRKY7、33、3、22、48、70、72和40等直接参与抗病反应[7-14]，这些蛋白有的参与腐生性病原菌抗性，有的参与寄生性病原菌的抗性，有的对二者都能产生抗性反应[15]。这些WRKY转录因子的抗病机制比较复杂，不断增加的研究报道说明，WRKY转录因子可以通过多种途径接受抗病信号，从而调控下游抗病靶基因的表达。

棉花是一种重要的经济作物，属于人们种植的主要作物之一[16]。棉花纤维是纺织工业的重要原料，是支撑纺织工业发展和人们生活的基础；同时棉籽油是食品和化工用油的主要来源之一，棉籽粕是一种牛羊等反刍动物的蛋白饲料添加成分[17]。棉花稳产性是保障种植效益的首要因素，然而，由大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae)引起的棉花黄萎病是影响当前棉花稳产性的最重要因素之一，因此，如何提高棉花品种的抗病性是当今棉花育种的一个主要目标。有关棉花抗病WRKY转录因子的研究已经有一些报道，如GhWRKY3[18]、GhWRKY40[19]和 GhWRKY1[20]。然而，棉花有116个WRKY蛋白，参与棉花抗病反应的WRKY蛋白鉴定和其抗病反应的分子机制等有待于进一步研究。

本研究中，通过比对拟南芥中抗病相关的WRKY蛋白序列，分别在陆地棉中获得这些蛋白的直系同源基因，分析这些GhWRKY基因对大丽轮枝菌侵染时的表达响应。筛选出了对病原菌反应剧烈的GhWRKY22基因，并对其进行基因沉默(Knockdown)的研究。结果显示，GhWRKY22基因沉默的植株对大丽轮枝菌的抗性下降，同时抗病标记基因(Marker genes)PDF1.2、PR1、PR3、PR4、PR5和PAL等的表达分析结果表明，GhWRKY22通过水杨酸(SA)和茉莉酸(JA)信号途径参与大丽轮枝菌抗性反应。总之，GhWRKY22基因正调控棉花对黄萎病的抗性，可以作为棉花抗病候选基因用于棉花的抗病育种。

1 材料和方法

1.1 试验材料

陆地棉遗传标准系TM-1(Gossypiumhirsutumacc. TM-1)以及棉花抗黄萎病品系BD18由山西省农业科学院棉花研究所罗晓丽研究员提供。

根癌农杆菌菌株 GV3101、大肠杆菌菌株 DH5α，均由中国科学院微生物研究所植物基因组国家重点实验室保存。

强致病力落叶型黄萎病菌菌株 V991 (Verticilliumdahliaestrain，V991)，由中国农业科学院植物保护研究所简桂良研究员惠赠。

植物病毒诱导基因沉默(Virus induced gene silencing，VIGS)技术系统，包括干扰表达载体 pYL156以及辅助载体 pYL192由清华大学刘玉乐教授馈赠。

1.2 基因序列比对分析与进化树构建

根据文献报道从模式植物拟南芥中选取抗病相关的WRKY编码蛋白作为对象，在棉花数据库(https：//www.cottongen.org)中进行Blast同源比对，获得了8个棉花直系同源WRKY编码蛋白，利用Clustalx 2.1软件进行氨基酸多重比对，并使用 MEGA 5.0邻接法生成系统进化树进行同源性分析。

1.3 棉花材料的培养

将干燥的硫酸脱绒种子在水中37 ℃浸泡过夜，移至培养盒中并在其上覆盖2～3 cm厚的灭菌湿润的蛭石，置于暗处，每天补充适量水分以保证种子正常萌发。大约3 d后，将长势一致的棉花幼苗移植到注满水的12孔水培盒中，放置于16 h光照/8 h黑暗、25 ℃、光强120 μmol/(m2·s)的培养箱中进行培养。每天定时观察适当加水确保棉苗正常生长，以备接菌和取样。

1.4 棉花根部RNA的提取及cDNA合成

剪取不同处理棉花样品，立即置于含液氮的研钵中迅速研磨成粉状，随后使用植物总RNA分离试剂盒(Sangon，上海)提取和纯化组织样品的总RNA，并用Nanodrop检测RNA样品的纯度与浓度，其后通过1.0% 的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA 的完整性，选择纯度和完整性优良的RNA进行cDNA合成。按照试剂盒提供的方法，用EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(Transgen Biotech，北京，中国)将1 μg RNA进行逆转录合成cDNA。反转录获得的cDNA稀释10倍置于-20 ℃冰箱保存。

1.5 基因片段克隆及载体构建

选取GhWRKY22基因特异的核苷酸序列设计引物，并分别在正向引物和反向引物前添加限制性内切酶BamHⅠ和KpnⅠ识别位点以及保护碱基(表1)。用TM-1遗传标准系陆地棉的cDNA为模板进行PCR扩增GhWRKY22基因，利用双酶切法将目的片段插入到植物病毒表达载体 pYL-156中；酶切和测序鉴定正确后命名为pYL-156-GW22。

1.6 农杆菌介导的VIGS植株培育

通过电击法分别将pYL-156-GW22、pYL-156-PDS(阳性对照载体)、pYL-156(空载体)和pYL-192辅助载体转化到农杆菌菌株GV3101中，PCR验证无误备用。

将上述农杆菌菌株在含有50 mg/mL卡那霉素、25 mg/mL利福平的液体LB培养基中于28 ℃，200 r/min培养过夜。菌液在室温下4 000 r/min离心7 min(Eppendorf 5810R，德国)收集农杆菌细胞。随后将沉淀的菌体重新悬浮于MMA(10 mmol/L MES，10 mmol/L MgCl2，200 mmol/L AS)溶液中，调节至终浓度OD600为1.0～1.2，将含有pYL-156-PDS、pYL-156-GW22和pYL-156(空载体)的农杆菌悬浮液分别与pYL-192等比例混合均匀，随后室温暗处孵育3 h备用。当BD18棉花2片子叶完全展开时，选取长势健壮一致的棉花幼苗进行农杆菌注射浸染。先用针头在子叶背面划出伤口，再用1 mL无针注射器将菌液从子叶背部伤口处注入，叶面浸染面积达90%以上为佳。侵染后的棉株室温避光12 h左右，随后移回光照培养箱中进行培养。

1.7 大丽轮枝菌活化和棉花接菌处理及其抗病性调查

将保存于-80 ℃的大丽轮枝菌菌株取适量均匀涂布于PDA培养基上，28 ℃暗培养3 d后，挑取菌块于100 mL查式培养液中，放置在28 ℃ 200 r/min摇床上培养，4～5 d后取出用8层医用纱布过滤菌丝，利用血球计数板计算孢子浓度，并用5%的蔗糖溶液调整其浓度为106个/mL备用。

TM-1棉花接种大丽轮枝菌的方法参考文献[21]报道，简而言之，取长势一致并具有3片真叶的棉株，对其主根进行统一伤根处理，将棉花根部浸泡到上述准备好的菌液中，50 min后放回水培盒中并置于光照培养箱中培养。收取0，12，24，36，48，72，96 h等不同处理时间的根样品进行棉花WRKY基因表达分析。

为了观察棉花植株发病情况，根据范强等[22]报道，采用土培法对基因沉默BD18植株进行接菌，并在接菌21 d后，统计植株的发病棵数和发病程度，计算发病率和病指。参照Wang等[21]报道，进行大丽轮枝菌回复培养试验，简而言之：分别剪取对照组与试验组第一节间的茎段进行表面灭菌(浸泡在25%～50%的84消毒液中5 min)后横向切成小段，放置在PDA培养基上，25 ℃培养5 d后观察这些切断的大丽轮枝菌生长状况。

1.8 SA和JA处理

棉花幼苗具有2片真叶时，分别用茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate，MeJA)和水杨酸(Salicylic acid，SA)进行激素诱导处理，具体方法参照先前报道的方法[23]。在激素处理0，0.5，1.0，3.0，6.0，12.0 h后分别取其根系，进行GhWRKY22基因诱导表达分析。

1.9 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析

以不同棉花样本cDNA为模板和目的基因特异引物(表1)进行qRT-PCR分析，具体反应体系按照TransStart Top Green qPCR SuperMix试剂盒使用说明(Transgen Biotech Beijing，China)进行配置，以棉花持家基因UBQ7为内参基因。反应使用的是IQ5多色检测系统(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)，反应条件为 95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，40个循环。数据处理采用2-ΔΔCt方法计算基因的相对表达量[24]，试验重复3次。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

2 结果与分析

2.1 生物信息学分析筛查棉花抗病相关WRKY基因

WRKY转录因子参与植物生长发育和抗性反应等一系列过程，能够调控多个生理途径基因表达。在拟南芥中，已经报道多个WRKY转录因子参与植株的抗病反应，主要包括WRKY7、33、3、22、48、70、72和40等(表2)。根据8个拟南芥WRKY抗病蛋白序列进行(直系)同源比对，在棉花基因组数据库中筛查到11个棉花WRKY转录因子，如图1所示，其中8个棉花WRKY转录因子分别与拟南芥的8个WRKY响应的聚合在一起，暗示它们可能是直系同源基因。这些抗病相关的WRKY转录因子分布在3个WRKY类型中，在Ⅱ型的5个亚类a、b、c、d和e中也分别存在，说明参与调控抗病反应的WRKY蛋白类型比较广泛。

表2 拟南芥抗病相关WRKY转录因子和其对应棉花直系同源基因Tab.2 Defense related WRKY transcription factors in Arabidopsis and their orthologous genes in cotton

2.2 棉花抗病相关WRKY基因在大丽轮枝菌侵染下的表达响应

棉花黄萎病是棉花的主要病害，其病原菌为大丽轮枝菌，因此，这8个与拟南芥直系同源的棉花WRKY基因表达是否对大丽轮枝菌产生应答响应，是研究这些GhWRKY基因抗病功能的前提。在水培盒中培养21 d大小的棉花苗被用于接菌试验。接种大丽轮枝菌后0，12，24，36，48，72，96 h进行根部取样，通过qRT-PCR方法分析这8个GhWRKY基因的表达情况。相对于0 h对照，其中有6个GhWRKY基因的表达在72 h之前均受到大丽轮枝菌诱导上调，另外2个WRKY基因(GhWRKY48和GhWRKY70)表达变化比较复杂，GhWRKY48的表达量总体呈现下降趋势，而GhWRKY70表现为升-降-升的趋势。在图2中GhWRKY7、GhWRKY40、GhWRKY22、GhWRKY3和GhWRKY72等5个WRKY基因表达量在24 h左右和72 h分别表现为上调，呈现出双峰曲线，暗示这5个WRKY基因的表达量可能受到水杨酸(SA)和茉莉酸(JA)2种激素信号的调控[25]。而GhWRKY48在病原菌浸染下总的表现为下降趋势，说明这个GhWRKY基因是一个负调控抗病的转录因子。

*.棉花直系同源基因。*.Orthologous cotton WRKYs.

热图的数值为相对表达量进行log2对数转换值，处理0 h相对表达量对数值为0。The log2 value of the relative expression level shown in the heat map，and the value of 0 h treatment level is regarded as 0.

2.3 GhWRKY22组织表达和植物激素诱导表达分析

从上述正调控抗病的5个GhWRKY基因中，挑选GhWRKY22进行深入的抗病功能分析。利用qRT-PCR分析棉花根、茎和叶器官中GhWRKY22基因表达量，结果显示，该基因在棉花根、茎和叶中均有表达，但存在显著差异(图3-A)，其在茎中表达量最高，在叶中表达量最低。在图2中已暗示GhWRKY22基因表达可能受到SA和JA抗病信号途径的影响，因此，分别外源使用这2种抗病相关激素处理棉花植株，然后检测GhWRKY22基因的表达情况。图3-B显示，在SA诱导3 h，GhWRKY22基因表达有了显著的升高；而在JA处理后6，12 h，该基因表达呈现显著上升。这些数据表明，GhWRKY22基因表达受到SA和JA信号途径的调控，从而参与棉花的抗病反应。

A.GhWRKY22在棉花不同组织中的表达，不同小写字母表示差异达5%(P<0.05)；B.SA和JA诱导下GhWRKY22表达情况。不同大写字母表示SA处理下差异性达5%(P<0.05)；不同小写字母表示JA处理下差异性达5%(P<0.05)。

2.4 GhWRKY22基因沉默植株的培育

为了进一步分析GhWRKY22抗病功能，利用病毒诱导基因沉默(VIGS)技术来培育GhWRKY22基因沉默植株，分析GhWRKY22基因表达抑制时棉花植株的抗病性。首先，利用NCBI数据库分析比对设计GhWRKY22基因特异靶序列(图4-A、B)。利用BamHⅠ和KpnⅠ双酶切把这个序列插入到烟草脆裂病毒(TRV)载体pYL156中，GhWRKY22构建病毒诱导基因沉默载体pYL-156-GW22(图4-B)。

A.GhWRKY22目的片段条带的克隆；B.pYL192辅助载体与pYL-156-GW22沉默载体构建示意图，pYL192载体大小为6.8 kb，其中包含RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)、运动蛋白(Moveprotein，Mp)、16 ku蛋白(16 ku)序列，一个具有自我剪切功能的核酶(Ribozyme，Rz)序列以及强启动子(2×35S) 和NOS终止子序列，pYL-156-GW22载体大小为 10.4 kb，其中含有一个衣壳蛋白(Coatprotein，Cp)序列，一个用于各种目的基因片段构建的多克隆位点(Multiple clone sites，MCS)等；C.GhPDS沉默植株叶片白化表型；D.GhWRKY22基因沉默分析，不同小写字母表示差异达5%(P<0.05)。图5-6同。

当棉花苗的2片子叶完全展开时，进行农杆菌注射浸染。空载体pYL156农杆菌作为浸染负对照，pYL156-PDS农杆菌浸染作为正对照，PDS基因被沉默的植株表现为叶片失绿，一般作为病毒诱导基因沉默的标记基因[22]。接种后的植株继续在培养箱中培养14 d左右，正对照植株呈现叶片失绿白化表型(图4-C)，说明TRV系统在棉花中具有系统的感染，并能成功地进行基因表达沉默。此时，GhWRKY22基因沉默植株的幼嫩叶片被取样进行表达量分析。结果表明，GhWRKY22基因在沉默植株中平均表达量显著下降了60%左右(图4-D)。选择GhWRKY22基因表达沉默60%以上的10个植株接种大丽轮枝菌，分析这些沉默植株的抗病反应。

2.5 沉默WRKY22基因植株对大丽轮枝菌的抗性分析

GhWRKY22沉默植株接种黄萎病菌21 d后，发现基因沉默植株表现为对病原菌侵染更敏感。相对于空载体沉默对照植株的发病症状，GhWRKY22沉默植株叶片黄色程度加重，落叶更多；GhWRKY22沉默植株的发病率和发病指数显著高于对照(图5-A-C)，发病株率和病情指数分别比对照升高了18百分点，20%，这些数据表明了GhWRKY22基因正调控棉花的抗病反应。为了进一步分析GhWRKY22基因的抗病功能，接菌沉默植株中大丽轮枝菌菌丝生长情况也被检测。首先分析接菌植株主茎断面在培养基上病原菌回复情况，结果显示，GhWRKY22基因沉默植株的病原菌回复率明显高于对照(图5-D)。归纳这些试验结果，可以证明GhWRKY22基因参与棉花对黄萎病的抗性，并且正调控棉花的抗病性。

GhWRKY22基因表达受到SA和JA激素的诱导(图3)，因此，GhWRKY22沉默植株对黄萎病的抗性下降，也可能涉及SA和JA信号途径中的基因调控。为了验证这个假设，利用qPCR技术分析SA和JA信号途径中抗病标志基因的表达情况。在GhWRKY22基因沉默植株和对照接种大丽轮枝菌21 d后，分析SA和JA抗病标志基因PR1、PR3、PR4、PR5、PAL1和PDF1.2表达水平。结果表明，基因沉默植株中6个抗病标志基因的表达量显著低于对照植株，其中PR4和PDF1.2的表达量下降最大，仅为对照的3.7%，8.7%。这些结果进一步表明GhWRKY22基因通过SA和JA信号途径参与棉花对大丽轮枝菌的抗性(图6)。

A.GhWRKY22基因沉默植株发病情况；B.发病株率，试验重复3次，共计60个植株；C.病情指数，试验重复3次，共计60个植株；D.接菌植株茎段恢复培养5 d后大丽轮枝菌生长情况。

图6 大丽轮枝菌浸染GhWRKY22沉默植株和对照中抗病标志基因的表达分析Fig.6 The relative expression level of defense marker genes in GhWRKY22-silenced plants treated with V. dahliae

3 结论与讨论

植物WRKY基因参与一系列的生理生化过程，包括植物的生长发育和对外界环境的抗性。其中有许多WRKY蛋白参与植物对病原菌抗性，在模式植物拟南芥中已经报道了许多WRKY转录因子参与抗病反应。然而在棉花中只有少数几个WRKY蛋白被报道参与抗病反应，如GhWRKY3[18]、GhWRKY40[19]和 GhWRKY1[20]。相比较于拟南芥，棉花中肯定存在着其他没有鉴定的WRKY蛋白也参与抗病反应。因此，利用比较基因组方法，通过生物信息学技术鉴定了8个与拟南芥直系同源的GhWRKY基因，通过接菌诱导反应显示棉花中这8个WRKY基因均参与大丽轮枝菌的应答反应。并利用基因沉默技术证明了GhWRKY22参与棉花的抗病反应。

本研究结果显示，8个棉花WRKY基因的表达受到大丽轮枝菌的诱导，但是诱导表达的趋势不同，GhWRKY7、GhWRKY72、GhWRKY40等6个WRKY基因表达一直为上调，而GhWRKY48的表达表现为下调，GhWRKY70的表达比较复杂。在棉花中前人已经报道了3个抗病相关WRKY，包括GhWRKY3[18]、GhWRKY40[19]和 GbWRKY1[20]。Guo 等[18]报道了GhWRKY3表达受到多种激素诱导，同时也受到立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)、棉花炭疽菌(Colletotrichumgossypii)和尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)的诱导。在SA、MeJA和ET处理下，GhWRKY40基因表达上调，正调控茄科植物对雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)抗性[19]。Li等[20]研究结果显示海岛棉GbWRKY1通过JA信号途径介导棉花抗病和发育的转变，负调控棉花对灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)和大丽轮枝菌抗性。在本研究中的8个直系同源的抗病WRKY基因包含着GhWRKY3和GhWRKY40，都是正调控棉花黄萎病的抗性反应。另外，本研究中有6个WRKY基因正调控棉花大丽轮枝菌应答反应，但同时也存在负调控应答反应GhWRKY48。拟南芥中，利用突变体和过表达植株也证明了WRKY48负调控细菌基础抗性以及PR基因的表达[11]；上面论述的海岛棉GhWRKY1也是一个抗病负调控因子；在番茄中，SlWRKY70的转录水平也表现为负调控植株对真菌的抗性[26]。因此，WRKY转录因子参与植物的抗病反应既可以是正向调控也可以是负向调控。

本研究表明，GhWRKY22基因受到大丽轮枝菌浸染的诱导，其表达量随着时间的变化呈现双峰形式的上调，利用VIGS技术确证了GhWRKY22正调控棉花对大丽轮枝菌的抗性。通过激素诱导GhWRKY22防御反应，发现其可能是受到JA和SA交叉信号转导途径的调控，是植物抗病反应中重要调控蛋白，有望成为一个新的棉花抗病育种的候选基因。Zhang等[27]也报道了一个棉花WRKY22基因的抗病功能，这个基因和本研究中的GhWRKY22基因是同源基因，不是拟南芥WRKY22的直系同源基因；然而有趣的是这2个基因都参与棉花对大丽轮枝菌的抗性，它们之间是否存在功能叠加或冗余现象有待深入的研究。在拟南芥中[10]，通过野生型与突变体wrky22-1和wrky22-2在淹水处理下比较，发现WRKY22也具有较低的抗病性和先天性免疫特性。此外，Abbruscato等[28]在水稻也报道了OsWRKY22基因位于信号转导回路的交汇点，参与对稻瘟病的抗性。总之，GhWRK22是一个抗病正调控转录因子，可以作为抗病候选基因用于棉花的抗病品种培育。