（联勤保障部队第909医院暨厦门大学附属东南医院 神经外科/无锡联保中心创伤神经外科中心，福建 漳州 363000）

神经胶质瘤是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤，其发生发展源自细胞增殖和/或凋亡的失衡，增加凋亡比重是放化疗治疗神经胶质瘤的重要机制[1-2]。B细胞淋巴瘤 2（B-cell lymphoma 2,Bcl-2）家族各亚型蛋白广泛参与胶质瘤细胞内生存/凋亡信号的转导调控。Bcl-2相关死亡启动子同源基因Bad编码蛋白是其中一类仅含保守性结构域的亚型，磷酸化和剪切修饰是其各种生化活性的重要基础。总结各种药物处理和内源性信号是如何通过调控Bad蛋白来实现对神经胶质瘤细胞内促凋亡或促生存信号通路的下游调控，有助于加深对神经胶质瘤细胞内线粒体凋亡通路的信号转导的理解，为寻找、设计、验证相关靶向药物治疗提供理论基础。

磷酸化的Bad（p-Bad）与14-3-3形成异二聚体，作为其伴侣分子定位于细胞浆；而非磷酸化Bad则通过结合含穿膜结构域的其他Bcl-2家族蛋白并形成异二聚体接近线粒体膜而发挥促凋亡作用。Bad在人体内呈组织特异性分布，在脑内尤其是内侧基底节区、下丘脑和海马区表达最高。生理组织中的Bad总蛋白只包含非磷酸化Bad这一种成分，可发挥正常的促凋亡作用。但在肿瘤的发生、发展过程中Bad蛋白表达呈升高趋势，由于各种生长因子信号途径激活，起凋亡抑制作用的p-Bad成分也在增加[3-5]。有研究报道在恶性胶质瘤U251、U87、U138细胞株和神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞株中p-Bad的表达升高[6]。

1 Bad调控神经胶质瘤细胞凋亡的一般机制

Bad能接受多种上游生存和/或凋亡信号并调控其转导，其生化功能与其磷酸化状态息息相关[7-9]。生存信号占主导时，Bad呈磷酸化状态与胞浆中14-3-3稳定结合。生存信号撤除或是接受上游凋亡信号后，Bad迅速去磷酸化并从Bad-14-3-3聚合物中解离。游离的非磷酸化Bad强烈干扰Bcl-xL-Bax聚合物的稳定性，将Bax从中置换出来而形成Bad-Bcl-xL聚合物。解离后的Bax结合成同源二聚体作用于线粒体外膜形成跨膜小孔甚至大孔径的线粒体通透性改变孔道，从而导致线粒体膜电位的变化和Cytc、AIF的外流，诱导凋亡事件的发生。对小脑颗粒神经元凋亡的研究还发现，单一的Bad去磷酸化并不足以触发凋亡机制，还需要抑制蛋白合成这一平行机制共同发挥作用。

2 Bad在神经胶质瘤中的磷酸化调节

2.1 Bad磷酸化的一般机制

Bad组成性序列中不同氨基酸位点的磷酸化状态的改变对Bad生化活性的影响也不尽相同[10-12]。p-Bad的去磷酸化是很多药物（NH4Cl、Raf抑制剂BAY 43-9006、FLT3抑制剂CEP-701、阿霉素）抑制生存信号途径和启动细胞凋亡的重要步骤，并且这一改变早于Bcl-2家族抗凋亡蛋白的表达降低和促凋亡蛋白的表达升高，而在这一过程中Bad总蛋白表达水平不变或增加。此外，p-Bad还可通过提高线粒体释放Cytc的阈值抑制凋亡，由此可见p-Bad并不仅以失活的形式被动地对凋亡产生影响，也可通过主动的方式来发挥抑制凋亡的作用即提高Cytc从线粒体释放的阈值。

2.2 神经胶质瘤细胞内各磷酸化位点的协同机制

Bad磷酸化失控是神经胶质细胞瘤发生的部分原因。c-Src的激活会上调PKCι的表达，PKCι的表达加强Bad S112、136、155磷酸化，从而增加神经胶质瘤细胞的增殖活性[10]。胶质瘤细胞内非磷酸化状态的Bad可在各种促生存信号如PIM-2激酶、p90（RSK）作用下磷酸化，从而抑制乃至逆转凋亡的发生发展。Bad的磷酸化对于各条生存信号通路都是关键性的。没有哪条促生存信号通路的活化能够拯救Bad磷酸化位点变异的胶质瘤细胞。另一方面，RNA干扰条件下，Bad总体表达受到阻滞的胶质瘤细胞则对凋亡信号敏感性降低。Bad S112和S136的磷酸化可以由IL-3、GM-CSF、PDGF、NGF或IGF刺激促成，在非毒性条件下甚至TNF也能完成这种磷酸化。磷酸化S112需要肾上腺素能α受体和β受体的同时激活，而磷酸化S155只需β受体的激活。S112有效磷酸化还需要活性PKA的参与，S155磷酸化可以增强S112磷酸化。可磷酸化位点的点变异则会取消Bad的磷酸化潜质，从而增强Bad蛋白的凋亡诱导能力。IGF-1受体能保护细胞免受各种凋亡刺激的诱导，其抗凋亡作用基于募集MAPK亚家族Akt/PKB和ERK的作用。IGF-1处理后的细胞Bax/Bcl-2比值降低，增加Bad S112和S136的磷酸化。p21-激活蛋白激酶可在S338和S339位点磷酸化激活Raf-1，后者在磷酸化Bad S112位点的同时将Bad从Bad-Bcl-2聚合物中替换出来，促使细胞向存活方向发展。但也有研究认为，Bad的磷酸化也不总是促使细胞向生存方向转化，JNK可通过磷酸化S128来推动凋亡，Bad蛋白S128的磷酸化通过抑制S136已磷酸化的Bad蛋白与14-3-3蛋白的联系，促成Bad的寡聚化而特异性地激活Bad蛋白。尽管如此，该研究也同时提出JNK可能并不是Bad S128的激酶，JNK信号激活后的S128位点的磷酸化状态可能与Bad促凋亡活性无关，这一观点尚需要更多的实验研究予以证实[13]。

BH3结构域内S155位点常被生存信号磷酸化，它的磷酸化改变对Bad/Bcl-xL的阻断作用相对S112和136位点而言是直接的。磷酸化导致Bad以G（i）alpha依赖性的方式从Bad/Bcl-xL聚合物中解离[14]。目前的研究对S155的磷酸化是否独立于S136位点的磷酸化意见不一。与Bcl-xL结合的Bad其S136被磷酸化以后构象发生改变，使得S155磷酸化成为可能，但是S155并没有已知的14-3-3结合序列，实际上，S155位点的变异并不影响Bad蛋白和14-3-3蛋白的结合，影响Bad与Bcl-xL的结合。在酵母和哺乳动物细胞中S136的磷酸化对维持Bad蛋白和14-3-3的联系是至关重要的，而S112位点的磷酸化则看似可有可无，因为该位点的变异并不影响Bad蛋白和14-3-3的结合。14-3-3与S136的亲合力比S112要高得多，S112位点变异导致的细胞凋亡可以由增强表达的14-3-3完全补救。

2.3 细胞毒性药物对神经元及胶质瘤细胞内Bad磷酸化的影响

NDGA和BFA孵育神经元60～90 min后即表现出p-Bad去磷酸化，而Bcl-2蛋白的表达则需孵育2～3 h后才降低。大鼠暂时性全脑缺血和创伤性脊髓损伤后神经元的凋亡与p-Bad去磷酸化水平呈正相关，p-Bad表达水平在脊髓损伤30 min后即降低并持续长达1 h。大麻素WIN 55212-2与胶质瘤细胞共孵育可导致p-Bad水平的下调但Bad总蛋白量并无变化；而醋酸亚铊与胶质瘤细胞共孵育则上调Bad总蛋白表达。PPARc激动剂诱导胶质瘤细胞凋亡过程中发生Bax和Bad蛋白表达水平的一过性上调。

神 经钙调蛋白 磷酸酶（protein-phosphatase 2B,PP2B）也是Bad蛋白的重要调控因子，在脑内大量分布，能在Ca2+低于10 nmol/L时保持适当的磷酸酶活性，一旦发生细胞内钙超载，p-Bad可被PP2B去磷酸化。氰化物通过类似的机制将p-Bad去磷酸化，并使其自细胞浆持续转运至线粒体外膜。PP2B的去磷酸化作用可能基于以下3点：①直接去磷酸化；②通过活化PP1将Bad去磷酸化；③PP2B诱导脑内cAMP依赖性PKA Ⅱ型调控单元的去磷酸化，从而使之活性降低，导致Bad S155位点的去磷酸化。事实上，S112位点的磷酸化是EGFR/MEK/ERK/MAPK依赖性，而S136位点的磷酸化是PI3K/Akt依赖的。2位点中的任意一个去磷酸化都将促使Bad与14-3-3分离，但只有2位点均发生去磷酸化而同时抑制2条生存信号通路才能导致Bad从与14-3-3的聚合体中释放出来并诱导凋亡的发生。

3 Bad的剪切修饰调节

3.1 Bad蛋白的常见剪切位点

药物处理或撤除生存信号发生凋亡的细胞其Bad和Bax之类的Bcl-2蛋白可通过Caspase依赖性剪切生成具有更强促凋亡能力的截短型蛋白[15]。反义Smad3的表达可以阻滞Caspase依赖性的Bad剪切进程，表明该进程为Smad3依赖性。Caspase蛋白可在Asp56和Asp61位点裂解Bad，Caspase-3和Caspase-7在Asp61发挥裂解作用。人Bad敏感的Capsase切割位点在相当于鼠Bad Asp56、Asp71的Asp4、Asp29。不同的死亡刺激信号促使不同的Caspase蛋白通过不同的作用位点剪切Bad，但尽管Caspase剪切可以加强人Bad的促凋亡活性，人Bad的剪切并非其促凋亡作用所必需的。Caspase-3通过Asp-61而不是Asp56切割Bad蛋白，而Caspase-7则只能切割鼠Bad蛋白而不能切割人Bad[16]。任何机制导致单纯Bad N-端的缺失并不总是足以激活其促凋亡活性，表明N-端的作用是保证促死亡功能不被激活，而不是一个直接的抗死亡域。

3.2 Bad剪切修饰与磷酸化调节的相互关系

撤除IL-3 4～6 h后的鼠骨髓前体32Dcl3细胞，其促凋亡蛋白Bad自N-端被裂解成26和15 kD的tBadL（truncated Bad large,tBadL）和 tBadS（truncated Bad small,tBadS）。内源性和增强表达的 tBadL 可以抑制神经元和其他细胞的死亡，但Caspases还可以通过裁减tBadL成类似于tBadS的促凋亡片断来进一步发挥促凋亡活性。tBadS仅存在于线粒体，这可能是因为细胞浆中tBadS具有高效的膜定位能力或者这种剪切发生在线粒体外膜，这也与Capase在线粒体的亚细胞定位、激活是一致的。tBadS其S112、S136、S155很少被磷酸化，这样就不能与14-3-3蛋白发生有效反应。这种低磷酸化可被强化的PP2B所修复。tBadS核心的BH3作用域得以暴露，这样与Bcl-xL亲合力更强，从而具有更强的促凋亡能力，并且由Bad与Caspase蛋白组成的正反馈循环又进一步放大这种凋亡诱导能力。此外，Caspase也能剪切Bcl-2和BclxL。有意思的是，虽然后两种蛋白一般被视作促生存信号蛋白，但是在Caspase剪切后将导致Cytc的释放而成为促凋亡信号蛋白。与之不同的是，Bax蛋白在被Caspase剪切成18 kD的片断之后，发挥更强的促凋亡作用。

4 Bad在沟通神经胶质瘤细胞周期信号和凋亡/生存信号中的作用

Bcl-2蛋白家族如Bad除了在众所周知的凋亡调控能力外还能影响细胞周期进程。细胞周期进程异常可能触发线粒体途径的激活，改变Bcl-2家族和促凋亡蛋白的平衡，推动凋亡的形成和发展[13]。表达于未发育成熟的大鼠小脑颗粒神经元的细胞周期调控蛋白激酶cdc2能介导颗粒神经元的凋亡，阻断其神经活性。cdc2磷酸化Bad蛋白S128位点，抑制S136磷酸化Bad与14-3-3的相互联系，拮抗生存因子对Bad促凋亡活性的抑制，从而介导颗粒神经元的凋亡。

p53与Bad蛋白的相互关系复杂。一方面，p53可以锚定于Bad基因起始密码子上游，参与控制Bad基因的转录和活化；另一方面，Bad蛋白又可以通过与p53蛋白的结合，抑制其进核后对Bad基因的转录调控。此外，在线粒体上形成的Bad/p53复合物还可以通过诱导Bad蛋白的活化和寡聚化促进细胞凋亡[17]。

5 Bad的研究展望

Bad蛋白在线粒体凋亡途径中发挥关键性的作用。内源性和外源性凋亡信号和药物处理信号都由Bad整理并转呈至线粒体外膜，藉此触发Caspase依赖性凋亡进程。在神经胶质瘤的发生、发展过程中，普遍存在着Bad和p-Bad的增量表达。很多放化疗处理都可以降低p-Bad表达或使之去磷酸化失活，剪切Bad形成tBad以增强神经胶质瘤细胞的凋亡。外源性导入表达的Bad也能较好地融入凋亡调控机制，促进神经胶质瘤细胞的凋亡发生。处于凋亡网络中枢的Bad是靶向治疗理想的候选物，围绕Bad开展的神经胶质瘤药物研究和基因治疗有望取得创造性的进展。