史馨瑾，孙海伟，王 俊，陈鸿军

（中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241）

流感病毒（Influenza virus）属于正黏病毒科，具有负股单链分段的RNA基因组。根据病毒内部蛋白抗原性不同，分为A、B、C、D型，绝大多数季节性流感均与A、B两种血清型有关，禽流感目前为止则只与A型有关。A型流感病毒根据其表面糖蛋白血凝素（HA）和神经氨酸酶亚型（NA）的组合，进一步分为多种亚型。目前已有18种HA亚型和11个NA亚型，其中大部分在野生鸟类中贮存[1]。主要有3种A型流感病毒亚型与人季节性流感有关，分别是H1N1、H2N2和H3N2型。而在B型流感病毒中，主要有两个系谱（B/Victoria和B/Yamagata）与人季节性流感有关，2017年年末，季节性流感的特征是以B/Yamagata系谱为优势流行株[2]。这几个亚型毒株每年感染5%～15%人类，导致全球约50万人死亡[3]。尽管经过数十年的监测和药物与非药物的干预，季节性流感病毒每年仍然会在世界各地引起流行病。造成这些流行病反复发生的关键过程病毒逃避先前感染或疫苗接种引起的免疫的进化[4]。流感病毒疫苗不得不定期更新，以跟上病毒进化的速度。

1 概述

A型流感和B型流感基因组均有8个RNA片段，编码至少12种病毒蛋白，包括编码病毒RNA依赖性RNA聚合酶PB1，PB2和PA、核蛋白NP、基质蛋白M1、病毒表面离子通道蛋白M2、与免疫逃避有关的NS1和介导病毒RNP核输出的NEP蛋白、病毒表面糖蛋白HA和NA，以及编码附件蛋白如诱导细胞死亡的PB1-F2蛋白[5]、调节病毒致病性的PA-X蛋白[6]等。流感病毒通过HA与细胞表面唾液酸受体结合，负责粘附和膜融合。NA则通过切割宿主细胞和新生病毒表面的唾液酸，阻止病毒在宿主细胞表面积聚，促进新生病毒粒子出芽释放。由于核苷酸复制的高错配率以及基因片段的不同组装形式，流感病毒通过点突变的积累和基因片段重组进行进化，分别被称为抗原漂移（antigenic shift）和抗原转变（antigenic drift）。

HA蛋白是流感病毒免疫反应的主要靶抗原，也是流感病毒疫苗的关键组分。在病毒粒子中，HA组成同源三聚体蛋白，每个单体含有球状头（HA1）和茎域（HA2）。HA抗体介导的免疫反应大多是针对球状头部的，但老年人体内也会出现直接针对茎部抗体[7]。

精准确定抗原漂移的分子决定簇一直是研究重点。自上世纪80年代以来，利用单克隆抗体和HA蛋白结晶结构分析，确定了5个广谱的抗原簇，每个簇都由球状头部上多个氨基酸残基（amino acid，aa）组成[8]。最近的一项研究表明，在A/H3N2病毒HA受体结合位点周围，仅7个Aa（按H3病毒HA氨基酸残基位置，在第145、155、156、158、159、189和193位）是1968～2003年间H3N2病毒抗原变异的主要位点。自2003以来的A/H3N2变异株都与这7个位点的变异相关[9]。

靶向HA茎部的抗体具有重要的生物学意义。因为在各亚型中HA茎部区域趋向于保守，所以针对茎部的抗体能够提供亚型间的保护[10]。靶向茎部抗体的抗原逃逸尚未被广泛报道。A/H3N2病毒只要通过单氨基酸Q387K替换，就可以在体外逃避茎部抗体[11]。

流感病毒NA抗体也能发挥一定免疫保护作用，该抗体可明显抑制人体内病毒复制。与HA相似的是，NA抗原分子决定簇也是比较集中的。NA抗原突变出现时间与HA抗原漂移也并非同步[12]。

2 病毒的进化限制因素

如上所述，负责A/H3N2病毒HA中的7个aa及其附近抗原位点的突变成为免疫逃逸关键限制因素。为了逃避针对HA的中和抗体，这些位置的突变必需引起抗原改变，而不扰乱受体结合功能，这是一个非常微妙的平衡关系。

唾液酸受体结合亲和力是限制抗原进化速率的重要影响因素之一[13]。在HA受体结合位点周围的抗原突变容易破坏病毒与受体的结合力。与唾液酸受体结合亲和力较高的病毒相比，唾液酸受体结合亲和力较低的流感病毒不易发生受体结合位点附近的氨基酸替换。这种受体结合平衡可以有效地限制抗原漂变。这解释了连续传播的流感病毒的抗原准种相对均匀性[14]。

基因链上基因出现氨基酸替换是进化限制的决定性因素之一。流感病毒的流行病学和进化动力学模型理论研究显示：为了获得那些改变病毒抗原性而对适应性没有影响的病毒蛋白质，该病毒需要获得多个基因的突变，抗原突变频率才可能受到限制[15]。另一种理论模型研究提出：对病毒适应性有害的突变体更会限制HA抗原漂变[16]。

除此之外，急性流感感染突变病毒出现概率亦受到先天性免疫的限制，使得引起宿主体内免疫逃避的抗原突变体并不常见。A型流感病毒RNA聚合酶每轮复制每个位点突变率约在2×10-6～2×10-4，所以每轮复制中，通过改变单核苷酸产生特定抗原突变数大致为2×105。因此，在一个感染的单细胞中，即可产生约104个准种病毒[17]，然而，即便突变体出现在第一轮复制中，在抗体产生之前，大量子代病毒在黏液纤毛层中就被清除。这类先天性免疫屏障系统很可能会大大减少新生成准种的种类数量，只有少数突变型病毒成功感染其他细胞[18]。

3 免疫选择压力

曾经研究者一直认为，流感病毒进化似乎来自之前感染或疫苗接种引起的免疫选择压力。然而，迄今为止，该现象的分子机制仍未找到明显的证据。事实上，最近一个研究通过测试166份个体样品，结果发现：由疫苗和之前感染造成的新抗原突变准种的出现率很低[19]。那么，宿主内免疫选择是如何影响病毒抗原进化的？

先天性免疫选择初次接触流感病毒后，机体粘膜屏障形成富含唾液酸的黏液层，通过唾液酸与HA蛋白结合而发挥诱饵作用，从而捕获大量病毒，有效地降低了感染数量。当流感病毒感染宿主细胞之后，Toll样受体（TLRs）和干扰素通路被迅速激活，大量产生细胞因子建立抗病毒状态，抑制周围细胞内流感病毒的复制[20]。总的来说，先天性免疫反应限制病毒进化是通过减少允许病毒繁殖的细胞可利用性和通过减少病毒多样性来限制流感病毒的进化，而并非依赖于抗原表型的变异[21]。

适应性免疫选择流感病毒反复感染和重复被动免疫，使得来自抗体和记忆免疫细胞的选择压力变得相当复杂。对于机体而言，免疫选择的强度取决于暴露于病毒或者疫苗抗原的频率，相似的抗原及衰减的免疫力均会导致免疫选择降低[22]。

在初次接触抗原的个体中，逃避先天免疫选择的病毒得以继续复制，并在感染后24～72 h后，达到高峰期，然而产生特异性抗体则需要7～8 d[23]，这导致首次感染时宿主体内对病毒几乎没有抗原选择性。急性流感病毒感染导致抗原瞬时暴露于适应性免疫系统中，然而，适应性免疫系统建立一个高度特异性免疫压力的必要条件却需要病毒能长期存在[24]。

上呼吸道黏膜免疫主要由IgA介导。为结合并中和流感病毒，IgA能够穿越血管上皮屏细胞到达上呼吸道管腔[25]。这一免疫反应会选择存在于感染过程的任何新突变株，是流感病毒进化的选择压力来源的关键因素之一。

二次感染由于存在抗原交叉性，大多会唤醒免疫记忆，然而，免疫记忆产生的抗体结合新抗原变体表面HA头部，不利于宿主免疫系统对新抗原突变体有效产生抗体应答[26]。

4 传播限制

新的抗原变异株可能会在传播给下一个宿主的过程中失去活性，除非能够在被感染的个体中复制到高水平。病毒种群的传播瓶颈主要发生在供体宿主排出病毒，进入受体宿主，尤其是穿越先天性免疫屏障的过程中。每一个瓶颈都可能很严重地导致新产生的病毒多样性受到重大损失。这些瓶颈随传播途径不同而变化，呼吸飞沫传播能力比直接接触传播具有更大的瓶颈[27]。

与宿主体内和个体间传播过程相似，较大规模的病原生态学对流感病毒的传播和进化影响很大，比如流感病毒流行的季节性、短暂性及病毒巨大多样性等因素。即使变异株较流行株产生良好适应性进化，但新的变异株也几乎没有时间与现有的流行株产生竞争，无法复制到高水平，亦没有机会孕育成流行株。

季节性流感病毒流行的时间在全球各不相同，在温带地区，大多数流感病毒感染发生冬季,在热带地区，则大多发生雨季[28]。动物攻毒模型结果证明：季节性流感病毒的呼吸道飞沫传播方式，在低温和低湿度的环境下，比在高温和高湿度的环境下，传播更有效[29]。这可以解释流感病毒流行区主要集中在南北半球的温带地区。然而，在热带地区，流感病毒的流行与雨季相吻合，在这期间温度和相对湿度都很高。这意味着，在热带地区，流感病毒通过直接接触或污染物传播比通过呼吸飞沫传播更为重要。因此，在热带地区与接触传播有关的更多瓶颈反而可促进流感病毒进化。

5 流感控制策略

疫苗是防控季节性流感的主要手段之一。疫苗接种在病毒进化中的影响比流感病毒感染在病毒进化中的影响要小，因为只有小于10%的世界人口是常规接种流感病毒疫苗的[30]。但是，疫苗的免疫效果却有着巨大的影响。因此，流感病毒疫苗的配方每年都要再评估两次，以确保疫苗种毒和未来可能造成流行的病毒相匹配。为了适应生产、运输和管理的疫苗所需要的时间，耗时长的疫苗生产过程主要是使用鸡胚生产技术，这期间为新的病毒突变体创造了一个窗口期，常导致疫苗免疫效力脱节。在人类适应性毒株在鸡胚中有效复制过程中，鸡胚生产疫苗技术也可能导致意外的疫苗毒株的抗原变异[31]。细胞培养技术可以更快地生产疫苗，为更有效的疫苗带来曙光。此外，相对于鸡胚和细胞培养技术，反向遗传学重组技术的大幅减少了疫苗种毒制备时间，一旦病毒基因组被测序出来，生产就可以开始了，而不是从活病毒筛选开始。如果大多数流感病毒疫苗是用重组技术生产的，疫苗株的快速确定可以更接近预期使用疫苗的时间，从而减少了人群中出现新变异株的窗口期。

除了及时更新流感疫苗以适应新型流感病毒以外，能迅速检测出新型流感病毒的检测方法对控制流感也非常重要。新型流感病毒的鉴定需要得到它的8个片段基因序列，通过序列比对和系统进化分析确定病毒亚型。此方法首先要获得序列，可以通过找到保守 PCR 通用引物，然后consensus PCR扩增获得其序列。然后直接测序获得基因序列[32]。该方法要求样品病毒滴度较高，而且实验周期较长。近年发展起来的高通量测序技术（high-throughput sequencing，HTS）能够更简单更全面检测病毒全基因组序列，该方法不需要进行细胞培养，直接对临床标本中的核酸池（pool）进行测序，但其检测特异性较低，因为建库过程中宿主基因组和环境微生物基因组不能完全去除。因此，高通量测序技术较适用于无法体外培养分离的病毒、高度变异病毒、重组病毒以及新病毒的鉴定和研究。

随着流感的变异，已有的抗流感药物面临严峻的耐药形势，抗流感药物也需要根据流感的进化不断研发更新。由于季节性流感中已出现广泛的M2离子通道耐药位点，目前WHO已不推荐烷胺类药物用于季节性流感的临床治疗。有广谱抗病毒活性的法匹拉韦，阻断翻译后阶段病毒血凝素成熟的硝唑尼特，PB2帽子结合区的抑制剂VX787等抗流感小分子药物陆续上市，有望在缓解流感进化导致的一线药物的耐药威胁[33]。

6 展望

虽然每年流感流行株呈现多样性，但病毒进化的选择压力发挥作用的机会却很少。机会减少的限制因素有：病毒生物学固有的（由于病毒可适应的突变数目有限）、免疫学固有的（先天性免疫、适应性免疫压力等）或流行传播固有的（因为流行传播和季节性的限制）。

三代测序的强大功能对研究流感病毒的进化非常有利。越来越精细的计算和数学建模整合了病毒和宿主间互作的不同数据源，特别是抗原变异数据，将对季节性流感病毒演变规律发挥重要的作用。另外，免疫谱序列可用于分析感染和接种期间的免疫应答反应，可以识别个体之间共享的宿主免疫应答标识，从而为影响病毒进化的宿主内和群体水平的选择性压力的系统特征提供有效的手段[34]。在疫苗设计阶段，这些精准的免疫标记可用于预测疫苗的免疫效力[35]。在未来，有理由相信，使用这些新兴技术解析病毒基因型的变化如何影响特异性免疫表型，用于流感病毒疫苗的新概念设计中，将会更好地控制流感大流行。