内皮祖细胞生物学特性的研究进展

2019-01-08田玲，周诺

中国比较医学杂志 2019年10期

田玲，周诺

(1.浙江省立同德医院口腔科，杭州 310000； 2.广西医科大学附属口腔医院口腔颌面外科，南宁 530021)

内皮祖细胞自1997年被Asahara教授[1]发现以来，与内皮祖细胞相关的研究接踵而至，学者们发现内皮祖细胞可在多个领域中发挥重要作用。内皮祖细胞主要来源于骨髓，外周血及脐带，其中骨髓中含量最高，且骨髓中内皮祖细胞的增殖能力是外周血的50倍[2]，但Epcs从骨髓中获取较难，培养基昂贵，如何促进其扩增及增强其生物学特性一直是一大难题。近年来，研究者们在研究中发现了多种促进内皮祖细胞增殖、迁移和动员等相关生物学特性有关的信号因子及信号通路，祖国传统医学中的多种中药亦发现对内皮祖细胞的功能有良好的促进效果，很多疾病通过改善内皮祖细胞的功能特性达到了良好的治疗效果，现将相关文献进行综述。

1 促进内皮祖细胞生物学特性的细胞因子

影响内皮祖细胞功能特性的细胞因子较多，这些细胞因子一方面给内皮祖细胞提供营养，一方面调控内皮祖细胞的增殖、迁移、动员能力，近年来人们研究较多的有以下几种：

1.1 血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)

血管内皮生长因子家族由以下成员组成：VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F、PLGF。最近，该家族又加入了内分泌腺衍生的血管内皮生长因子(EG-VEGF)。VEGF的受体称为VEGFR，主要有以下几种：VEGFR-1、VEGFR-2(又称KDR)、VEGFR-3(又称Flt-4)。VEGFR-1和VEGFR-2主要在血管内皮细胞上表达，VEGFR-3主要在淋巴内皮细胞上表达。血管内皮生长因子(VEGF)是一种重要的促血管生成活性的生长因子，对内皮细胞具有促进分裂和抗凋亡作用，还可增加血管通透性，促进细胞迁移，它在调节正常和病理性血管生成过程中起积极作用，对内皮祖细胞的生长也存在重要作用。张文斌等[3]用含不同浓度的VEGF的培养基培养内皮祖细胞，发现用较低浓度的VEGF培养内皮祖细胞时，内皮祖细胞的粘附能力、迁移能力、增殖能力等都得到了增强，但VEGF浓度较高时增强效果反而不明显[4]；崔斌等[5]用含VEGF的培养基培养内皮祖细胞后，发现其能促进Epcs的数量及分泌eNOS的功能。王伟等[6]转染了VEGF基因到Epcs后，发现Epcs分泌VEGF的能力和内皮祖细胞的增殖能力均得到了提高。

1.2 缺氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor 1, HIF-1)

HIF-1是一种调节新生血管形成的转录因子。HIF-1α是HIF-1的α亚单位，是调控HIF-1转录活性的缺氧传感器。缺氧时，脯氨酰羟化酶(PHDs)的活性受到抑制，进而抑制HIF-1α的泛素化，导致HIF-1的激活[7]。HIF-1还能促进新生血管化和神经发生，有利于神经从缺血性损伤中恢复。但是，在脑缺血的急性阶段，过度激活的HIF-1会损害血脑屏障。Liu等[8]用慢病毒沉默了小鼠HIF-1α基因，发现其降低了内源性和外源性骨髓来源的内皮祖细胞的归巢功能，并发现其可能导致了VEGF-A、VEGF-A/FLK-1、NRP1和DLL4表达的降低，推测HIF-1α可能通过CXCL12/CXCR4和Hmg1参与EPCs归巢，并通过VEGF-A/flk1-nrp1/dll4信号通路促进骨髓来源的EPCs形成新生血管。姜萌等[9]用质粒转染HIF基因到Epcs中，使Epcs过表达HIF，检测后发现HIF基因转染成功后Epcs表达FLK、VEGF、eNOS等下游蛋白均增多。

1.3 基质生长因子(stromal cell-derived factor- 1, SDF-1)

SDF-1是由间充质干细胞分泌的一种细胞因子，是一种重要的调节干细胞和祖细胞进出骨髓微环境的细胞因子，血清中SDF-1的浓度与循环中内皮祖细胞的含量关系较密切。有学者比较发生了高风险非损伤性脑血管和低风险非损伤性脑血管的两组患者外周血中SDF-1含量和Epcs数量及迁移情况，发现发生了高风险非损伤性脑血管组的患者血清中SDF-1浓度低于低风险非损伤性脑血管组，而EPCs的增殖和迁移率也低于低风险非损伤性脑血管组，对于短暂性脑缺血发作和轻微脑卒中患者，可用循环EPCs和血清SDF-1浓度来预测高风险非损伤性脑血管发生，他们认为循环内皮祖细胞增殖和迁移的减少可能与高风险非损伤性脑血管发生有关，表明血清中SDF-1的浓度与循环中内皮祖细胞的含量存在一定关系[10]。

1.4 去甲肾上腺素(norepinephrine, NE)

有研究证明NE可促进内皮祖细胞的增殖、迁移能力，姜其钧等[11]给左下肢缺血的实验组小鼠持续性注入去甲肾上腺素，对照组给予生理盐水注射，结果发现实验组小鼠外周血、骨髓、脾脏的内皮祖细胞数量较对照组均上升，并证明NE是通过Akt-eNOS信号通路调节了此过程。

还有很多细胞因子也可影响内皮祖细胞的生物学特性，如Chen等[12]发现BMP-2可促进Epcs的迁移和成管，有研究发现整合素α6的上调与 Epcs的血管生成功能有关[13]。

2 信号通路

目前许多正在进行的工作集中在通过操纵信号通路来改变细胞内蛋白的表达，如操控Wnt/β-catenin和骨形态发生蛋白通路，减少了干细胞的异质性，促进了干细胞移植治疗的可行性[14]；激活SDF-1/CXCR4信号通路调控内皮祖细胞动员到受损伤区域等。当前研究较多的通路有以下几条：

2.1 基质衍生因子/趋化因子受体-4 (SDF-1/CXCR4) 信号通路

SDF-1，即基质衍生因子-1，又称 CXCL12，属于CXC趋化因子家族。它的N段是受体结合所必需的，特征是7个跨膜结构域与G蛋白结合，是结合及激活趋化因子受体的区域。SDF-1的受体是CXCR4，CXCR4是由352个氨基酸分子组成的蛋白质，当CXCR4被激活时，它会将多种信号转换成对细胞的趋化，分化，凋亡等生物功能的控制。CXCR4表达在多种细胞上，包括淋巴细胞，单核细胞等血细胞，造血干细胞及胚胎干细胞，在内皮细胞上也有表达，已有研究证明其激活无论在体内或体外均能促进血管形成[15]。

SDF-1/CXCR4轴在胚胎发育过程中起着至关重要的作用，主要功能之一是调节胚胎发育过程中祖细胞的运输，调控细胞趋化和归巢到机体受损伤的部位[16]。SDF-1/CXCR4对Epcs的影响一方面在于SDF-1吸引了Epcs从骨髓动员到外周血，另一方面在于目前公认内皮祖细胞表达CD34，Askari等人[5]研究发现CD34+细胞表达CXCR4，而SDF-1可诱导CD34+细胞迁移和血管生成。

近年来，此信号通路介导的祖细胞动员还被广泛应用于临床研究中，如运用于器官移植、球囊血管成形术或支架植入术后观察到的血管损伤诱导的再狭窄模型中进行研究[17-18]。

2.2 磷脂酰肌醇-3-激酶/丝苏氨酸蛋白激酶 (PI3K/AKT)信号通路

PI3K是由一个110×103大小的催化亚基(p110)和一个85×103大小的调节亚基(p85)组成的二聚体。PI3K下游可影响细胞凋亡，细胞分化，细胞内囊泡转运等。P110亚基在细胞膜内表面产生pip3，pip3可吸收pdk1，然后pdk1磷酸物激活AKT，进而激活下游通路。AKT，即丝氨酸/苏氨酸激酶，称作蛋白激酶B或PKB，是一种原癌基因，AKT激酶家族包含三种亚型，AKT1、AKT2、AKT3，与细胞生存生长有着密切关系。其中AKT1是最多的，由pdk1和pdk2磷酸化。AKT2在对胰岛素起反应的组织中表达，如肌肉组织，它对葡萄糖代谢起着重要作用。Akt3在脑和睾丸中表达较多。PI3K/AKT的下游可调节eNOS的表达。NO主要由eNOS合成， eNos通路能促进eNos的表达，从而使NO的分泌增多，刁玉刚等[19]将eNOS基因转入大鼠的Epcs后，发现培养基中NO含量明显增高。

Cao等[20]对糖尿病小鼠和健康小鼠的Epcs分别进行培养，MTT法结果表明糖尿病患者Epcs的活力低于健康小鼠，用西红花酸治疗后，糖尿病组Epcs的增殖能力得到了改善，且迁移能力得到了提高，研究人员发现此现象与PI3K/AKT信号通路有关，西红花酸增加了pAKT和p-eNOS的表达，从而激活了PI3K/AKT/eNOS信号通路，恢复受损伤Epcs产生eNOS的能力。Li等[21]使Epcs的LncRNA WTAPP1基因分别过表达和沉默，发现LncRNA WTAPP1可通过PI3K/AKT调节MMP-1的表达，积极调节Epcs的迁移、侵袭功能和体内外成管能力。

马颖等[22]用差速贴壁法培养内皮祖细胞，检测PI3K、AKT、AC133、vWF等的mRNA及蛋白的表达水平，发现AC133, PI3K、AKT的表达随时间推移逐渐减弱，vWF的表达没有变化，提示PI3K/AKT信号通路参与了内皮祖细胞分化为内皮细胞的过程，可能促进了内皮祖细胞的分化。

2.3 Wnt信号通路

Wnt信号通路是由Wnt蛋白与胞膜上的受体结合激活，根据其是否有β-catenin分为经典Wnt信号通路和非经典Wnt通路。刘凯等[23]用机械力及成血管诱导液共同刺激内皮祖细胞，发现β-catenin及下游的VEGFA蛋白表达均显著增强，同时PCR结果显示与Wnt信号通路相关的一系列相关蛋白的基因表达亦增强。崔斌等[24]用氯化锂抑制Wnt信号通路负性调控蛋白GSK-3的表达，以激活Wnt信号通路，发现Wnt通路关键调控蛋白β-catenin及下游Cyclin D1表达均增加，内皮祖细胞的增殖也明显增加；余涛[25]在体外构建沉默Wnt3a基因的重组质粒，用脂质体作为介导将质粒转入小鼠内皮祖细胞中，发现沉默了Wnt3a的小鼠内皮祖细胞的增殖受到了明显抑制。Wnt非经典通路亦被研究发现可调控内皮祖细胞的生物学特性，杨栋等[26]在培养内皮祖细胞的培养基中加入外源性的Wnt5a，发现内皮祖细胞的增殖能力、迁移能力和成管能力均增加。

还有很多信号通路也被报道与Epcs有关，如李小林等[27]发现NOTCH信号通路可促进内皮祖细胞的增殖分化，尹华曦等[28]发现雌激素可通过MAPK通路促进内皮祖细胞的增殖和迁移能力，战丽丽等[29]发现补肾活血中药可通过激活MMP-9信号通路促进内皮祖细胞从骨髓动员到血液循环。

3 中药对内皮祖细胞的影响：

近年来很多学者发现中药可作为内皮祖细胞功能的调节剂调节内皮祖细胞的功能，研究较多的主要有以下几种：

3.1 黄芪多糖

吴青等[30]用含黄芪多糖的M199培养基培养内皮祖细胞，发现800 mg/L的黄芪多糖能显著促进Epcs的增殖，且此现象能被PI3K阻断剂LY294002阻断，Western blot结果提示黄芪多糖能促进Epcs的Akt、eNOS磷酸化，表明黄芪多糖可能是通过此通路促进内皮祖细胞功能。

3.2 补肾活血中药

戴国华等[31]每日用补肾活血中药给心肌缺血的小鼠灌胃，对照组仅给予生理盐水，一个月后取两组小鼠的外周及骨髓的Epcs进行培养，发现给药组Epcs的数量较对照组明显增多，同时VEGF、SDF-1α的表达亦增多，此中药可有效促进Epcs的增殖及相关功能。

3.3 丹酚酸

封亚丽等[32]从健康人的外周血中分离出Epcs并进行培养，7 d后换成含丹酚酸的培养基进行培养，然后对内皮祖细胞的增殖、分化和旁分化能力进行测定，发现丹酚酸处理后的内皮祖细胞的增殖能力及培养基上清液中VEGF、SDF-1 及 IL-8 水平均增加。刘璐菘等[33]做了类似的实验，也得出来了相似的结果，表明丹酚酸可促进内皮祖细胞的增殖功能及自分化、旁分化功能。

3.4 姜黄素

骆明炎等[34]用不同浓度的姜黄素处理内皮祖细胞，发现低浓度姜黄素对内皮祖细胞的增殖、迁移、粘附等功能有促进作用，高浓度则相反，并发现适宜浓度的姜黄素可能抑制骨钙素的表达，从而改善心血管患者的血管功能。

3.5 鹿茸

贺怡然等[35]发现鹿茸可促进骨髓来源的内皮祖细胞修复内皮的功能，他们给予下肢缺血的小鼠分高、中、低三个剂量进行灌胃给药，然后抽取小鼠的腹主动脉血进行培养，发现高剂量的鹿茸能显著促进Epcs的增殖和VEGF、NO的表达，从而促进内皮修复，改善机体的缺血状况。

3.6 柚皮苷

赵志虎等[36]用不同浓度的柚皮苷培养来自骨髓的Epcs，发现500 μg/mL的柚皮苷能显著促进内皮祖细胞增殖及SDF-1α，CXCR-4等基因及蛋白的表达，而加入柚皮苷组与加入CXCR-4抑制剂及PI3K抑制剂组比，成血管能力上升，表明柚皮苷促进内皮祖细胞的增殖及生物学特性可能与SDF-1α/CXCR-4/PI3K/AKT功能轴有关。

目前，中药促进内皮祖细胞生物学特性的影响机制还不甚了解，未来还需做更多的研究，方能更恰当的将中药运用到内皮祖细胞的调节中来。

4 内皮祖细胞在临床疾病治疗的研究进展

近年来学者们发现有很多疾病可通过改变内皮祖细胞生物性能来进行治疗或改善症状，如光疗促进内皮祖细胞的生物学性能:有研究者发现光疗能显著促进Epcs动员到循环中，他们运用光疗治疗患有呼吸窘迫综合征的患儿，发现光疗可增加循环中Epcs的数量，促进Epcs增殖，成管，趋化等，改善肺的功能，从而改善了其呼吸功能，未来有望通过此方法改善患有呼吸窘迫综合征患儿的呼吸情况从而达到预防支气管肺发育不良[37]。还有研究者同样用光疗治疗患有严重高胆红素血症的婴儿，发现光照促进Epcs的动员，证明光疗能促进Epcs在循环中富集，并能影响Epcs的生物学特性，而在体外实验中发现光疗后，Epcs的迁移和成管能力也会增加[38]。Epcs还与糖尿病有关，Epcs参与了内皮功能障碍和新生血管的形成，故内皮祖细胞功能紊乱可能是糖尿病引发的血管并发症的基础。许多研究中表明糖尿病患者的Epcs功能受损[39]，故目前很多糖尿病治疗的研究都着力于恢复Epcs功能上，Cao等[20]用含西花黄素的培养基培养糖尿病小鼠骨髓来源的Epcs，发现原本受损伤的Epcs的活力，迁移能力以及eNOS生成能力均得到恢复，他们认为西花黄素有望作为潜在的治疗糖尿病的药物。Simin 等[40]发现胰岛素联合二甲双胍治疗能促进糖尿病病人的Epcs进入循环的量，同时伴有Epcs增殖、迁移、分泌、克隆和成管活性的增加，从而保护了糖尿病患者的血管，胰岛素是一种对Epcs至关重要的生长因子，它能刺激内皮细胞的血管形成，修复内皮损伤。但二甲双胍需与胰岛素共同作用，仅使用二甲双胍则会抑制血管形成，降低血清中VEGF的量。