许 莹，田 虎，于 剑，程佳林，赵玉成

1山东大学附属山东省千佛山医院普外科，济南 250014 2泰山医学院研究生学院，山东泰安 271000

特洛细胞第1次被发现并进行命名是由Popescu在科研过程中无意发现的区别于普通间质细胞、却又来源于间叶组织的细胞时完成的，距今已有30余年[1]。在这30年里，国内外大量科研团队从特洛细胞存在的可能性、检测细胞可能表达的生物免疫标志物、3D透视电镜下的形态以及可能与其周围细胞存在的相关联系等方面进行了深入的研究，研究显示特洛细胞广泛存在于生物体的各个组织中，如存在于人体的心脏[2]、肾脏[3]、皮肤[4]、子宫等系统[5]，肺脏[6]、大肠[7]、肝脏[8]等几乎所有的空腔脏器和实质脏器中，而且还存在于除人类以外的哺乳动物体内[9-18]。在某些疾病的发生发展过程中也同样伴随着特洛细胞的改变，如目前已明确的在心肌梗死心肌组织中，特洛细胞作为一种具有类似于纤维细胞功能的间质细胞在心肌梗死带边缘形成三维立体框架结构为新生心肌细胞提供构建的网状结构[19]。ApoE基因敲除小鼠作为经典的用于动脉血管粥样硬化研究的动物模型已成熟地被应用于血脂异常等疾病的研究过程中[20]，此种小鼠在繁育的过程中被人为地敲除了部分细胞核内DNA基因，导致小鼠先天性缺乏ApoE基因，并在高脂饮食的情况下使动脉血管壁更容易产生粥样炎症性斑块，较正常小鼠在同等高脂饮食条件下形成动脉粥样硬化的时间明显缩短，因此成为临床研究动脉粥样硬化疾病的经典动物模型，而且也是在全世界范围内得到公认的动物模型。特洛细胞作为近年热门的研究方向，虽然已经在正常小鼠体内的多器官中明确证实存在特洛细胞，而且可能参与了部分疾病的发生发展过程，但在ApoE-/-小鼠形成动脉粥样硬化的过程中是否参与疾病发生发展的过程，依然缺乏基础实验的根据。本研究作为课题组研究的首批实验结果，对特洛细胞在ApoE-/-小鼠心脏、肝脏及肾脏3大主要器官中的形态学差异进行系统的研究总结，为接下来的课题研究提供坚实的理论基础。

材料和方法

获取动物标本选取由北京维通利华实验动物技术有限公司提供的ApoE基因敲除小鼠10只(No. 11400700287821)，雄性，无特定病原体级别，体重62 g，高脂饮食2周。小鼠饲养于山东省千佛山医院医学研究中心动物实验室内，室温22 ℃，相对湿度55%，鼠笼大小为80 cm×50 cm×45 cm(可保证小鼠活动自由，饮食饮水自由)。应用10%水合氯醛注射液对小鼠进行腹腔内灌注麻醉，根据0.04 ml/g水合氯醛为单位剂量计算小鼠麻醉药物使用总量。麻醉成功后将小鼠放置于解剖台上，固定四肢，常规消毒铺巾，先取腹部正中切口快速切取肾脏组织、肝脏组织，然后打开胸腔取心脏组织，将以上组织放入室温下含有4%多聚甲醛的标本固定液中，固定标本24 h。随后将组织用石蜡包埋，切片，备行免疫组织化学。上述动物实验已通过山东省千佛山医院医学研究中心伦理委员会的备案及同意(伦理号为：伦审字S0090号)。

免疫组织化学石蜡切片脱蜡至水：依次将切片(病理切片机出自上海徕卡仪器有限公司，RM2016)放入二甲苯和无水乙醇脱蜡并应用蒸馏水水洗(脱水机出自武汉俊杰电子有限公司，JJ-12J)。抗原修复：组织切片置于柠檬酸抗原修复缓冲液(pH6.0)的修复盒中于微波炉内进行抗原修复，自然冷却后将玻片置于PBS(pH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次(涡旋混合器和掌上离心机出自谷歌生物公司，MX-FMX/D1008E)。血清封闭：在组化圈内滴加3%牛血清白蛋白均匀覆盖组织(组化笔出自Gene tech公司，GT1001)，室温封闭30 min。加一抗：在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗(CD34，ABCAM公司，AB81289，稀释比为1∶3000；CD117，Servicebio公司，GB11073，稀释比为1∶500；PDGFR，Servicebio公司，GB11261，稀释比为1∶200；CD28，ABCAM公司，AB203084，稀释比为1∶200)，随后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗(辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗，Servicebio公司，G23303，稀释比为1∶200)覆盖组织，室温孵育50 min。辣根过氧化氢酶显色：在圈内滴加新鲜配制的辣根过氧化氢酶显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色。复染细胞核：Harris苏木素复染细胞核。显微镜镜检(1～400倍任意放大扫描，显微镜出自CIC公司，XSP-C204)，并进行图像采集。免疫组织化学染色分析根据染色光密度对阳性标记分为3种等级，分别为弱(+)、中(++)、强(+++)，相对应的颜色变化为淡黄色细颗粒、棕黄色颗粒、褐黄色粗颗粒。图像选取过程中以尽可能选取强阳性染色为原则。

结 果

心肌组织在ApoE-/-小鼠的心肌组织中，通过免疫组织化学的方法可以清晰地看到特洛细胞的形态结构：不规则的胞体和多条细长的串珠样、伪足样结构。特洛细胞存在于心肌细胞之间，根据不同的心肌细胞的走形表现出不同的形态，相邻特洛细胞之间由细长的Telopodes相联系，形成类似于网状结构的分布现象。选取CD34、CD117和CD28 3种免疫组织化学生物指标对心肌细胞进行单标染色后，结果显示心肌组织内特洛细胞表达CD34+、CD117+、CD28+(图1～3)。

心脏组织中的特洛细胞对CD34阳性表达，表现为棕染；周围细胞通过苏木素染色细胞核呈蓝染

CD34-positive Telocytes in myocardium tissue are stained brown；the surrounding cells are counter-stained blue by hematoxylin

图1心肌组织特洛细胞免疫组织化学CD34+单染(×400)

Fig1Single immunohistochemical staining for CD34-positive Telocytes in myocardium tissue (×400)

心脏组织中的特洛细胞对CD117阳性表达，表现为棕染；周围细胞通过苏木素染色细胞核呈蓝染

CD117-positive Telocytes in myocardium tissue are stained brown；the surrounding cells are counter-stained blue by hematoxylin

图2心肌组织特洛细胞免疫组织化学CD117+单染(×400)

Fig2Single immunohistochemical staining for CD117-positive Telocytes in myocardium tissue (×400)

心脏组织中的特洛细胞对CD28阳性表达，表现为棕染；周围细胞通过苏木素染色细胞核呈蓝染

CD28-positive Telocytes in myocardium tissue are stained brown；the surrounding cells are counter-stained blue by hematoxylin

图3心肌组织特洛细胞免疫组织化学CD28+单染(×412)

Fig3Single immunohistochemical staining for CD28-positive Telocytes in myocardium tissue(×412)

肝脏组织在ApoE-/-小鼠的肝脏组织中，同样可以观察到特洛细胞的形态结构:不规则的胞体和数条Telope的串珠样、伪足样结构。选取CD34、CD117和血小板衍生生长因子受体-α(plateled-derived growth factor receptor-α，PDGFR-α)3种免疫组织化学生物指标对肝脏组织进行单标染色，结果显示肝脏组织内特洛细胞表达CD34+、CD117+、PDGFR-α+。CD117阳性表达和PDGFR-α阳性表达的特洛细胞广泛分布在肝组织内，其中PDGFR-α阳性表达的特洛细胞仅表达Telopode，而特洛细胞胞体未显示阳性染色；CD34阳性表达的特洛细胞在肝脏组织内的分布有所差异，围绕在毛细肝管周围的特洛细胞明显多于肝细胞之间的特洛细胞数量，且肝细胞之间的特洛细胞之间并未表现出明显的三维网状支架结构(图4～6)。

肝脏组织中的特洛细胞对CD117阳性表达，表现为棕染；周围细胞通过苏木素染色细胞核呈蓝染

CD117-positive Telocytes in hepatic tissue are stained brown；the surrounding cells are counter-stained blue by hematoxylin

图4肝组织特洛细胞免疫组织化学CD117+单染(×423)

Fig4Single immunohistochemical staining for CD117-positive Telocytes in hepatic tissue (×423)

肝脏组织中的特洛细胞对CD34阳性表达，表现为棕染；周围细胞通过苏木素染色细胞核呈蓝染

CD34-positive Telocytes in hepatic tissue are stained brown；the surrounding cells are counter-stained blue by hematoxylin

图5肝组织特洛细胞免疫组织化学CD34+单染(×400)

Fig5Single immunohistochemical staining for CD34-positive Telocytes in hepatic tissue (×400)

PDGFR-α：血小板衍生生长因子受体-α

PDGFR-α：plateled-derived growth factor receptor-α

肝脏组织中的特洛细胞对PDGFR-α阳性表达，表现为棕染；周围细胞通过苏木素染色细胞核呈蓝染

PDGFR-α-positive Telocytes in hepatic tissue are stained brown；the surrounding cells are counter-stained blue by hematoxylin

图6肝组织特洛细胞免疫组织化学PDGFR-α+单染(×400)

Fig6Single immunohistochemical staining for PDGFR-α-positive Telocytes in hepatic tissue (×400)

肾脏组织ApoE-/-小鼠肾脏组织分为3种结构即肾皮质、肾髓质和肾集合系统，选取CD34、CD117和PDGFR-α 3种免疫组织化学指标分别单染肾脏的以上3个结构，发现肾脏内特洛细胞对CD117和PDGFR-α阴性表达，肾小管上皮细胞却对以上两种免疫标记物出现阳性表达；在肾脏的3种不同结构中的特洛细胞对CD34阳性表达，特洛细胞在肾髓质内存在最为密集广泛，形成的细胞间网状结构最为明显，其次是肾皮质和肾集合系统，且特洛细胞形成的三维结构皆围绕肾小管分布，在肾小球周围少见(图7～11)。

肾脏组织中的特洛细胞对PDGFR-α阴性表达；蓝色细胞核为经苏木素染色后表现

Telocytes in renal tissue are expressed PDGFR-α negative；the surrounding cells are counter-stained blue by hematoxylin

图7肾组织特洛细胞免疫组织化学PDGFR-α-单染(×132)

Fig7Single immunohistochemical staining for PDGFR-α-negative Telocytes in renal tissue (×132)

肾脏组织中的特洛细胞对CD34阳性表达呈棕色；周围细胞核经苏木素染色后呈蓝色；在肾小管周围，特洛细胞之间形成三维网状结构

CD34-positive Telocytes in kidney tissue are stained brown；the surrounding cells are counter-stained blue by hematoxylin；Telocytes form three-dimensional net structures around kidney tubules

图8肾集合系统特洛细胞免疫组织化学CD24+单染(×400)

Fig8Single immunohistochemical staining for CD24-positive Telocytes in renal collecting system (×400)

讨 论

特洛细胞是一种具有极长极薄端足的新型间质来源的细胞。自从Popescu 和Faussone-Pellegrini[1]率先将这种特殊的间质细胞用希腊文字命名为“Telcell”，为了更多的掌握此细胞的存在方式、形态结构和功能，国内外许多科研团队越来越多地开始关注特洛细胞。目前已证实特洛细胞分别存在于人和实验哺乳动物的各种空腔脏器性和非空腔脏器中。虽然近年来流式细胞术和免疫组织化学被引入到特洛细胞的研究中，但迄今为止，透视电镜仍然是鉴别不同组织和器官中特洛细胞的“金标准”[1-2]。特洛细胞参与细胞间信号转导或免疫调节，但更多未知的功能还需要探索。在2010至2018年，总共有332篇关于“特洛细胞”的科研报道，其中有2829条被引用在“科学网”上，关于特洛细胞的出版物和引文呈逐年上升的趋势。1889年，西班牙神经解剖学家圣地亚哥-拉莫和卡贾尔首次描述了一个纺锤形或三角形细胞，该细胞在肠道肌层和浆膜层中呈网状结构。这些特殊细胞存在于神经末梢和平滑肌细胞之间的间质中，将两者细胞联系在一起。在随后的70～80年里，特洛细胞的存在、性质和功能在不同的科学家群体中引起了很大的争议。到20世纪60年代，Taxi和 Eugène[25]首先描述Cajal间质细胞是一种新的细胞类型，它不同于神经元、Schwann 细胞、平滑肌细胞、纤维细胞和具有超微结构的巨噬细胞。此后不久，Thuneberg[22]、Faussone Pellegrini等[23]分别证明了此间质细胞不是神经元，而是胃肠运动和神经传导的起搏器。

存在于肾皮质和肾小管周围的特洛细胞从形态和数量上皆区别于其他部位的特洛细胞，周围细胞核经苏木素染色后呈蓝色

The morphologies and amount of Telocytes differ between cortex renis and kidney tubules;the surrounding cells are counter-stained blue by hematoxylin

图9肾皮质区特洛细胞免疫组织化学CD24+单染(×400)

Fig9Single immunohistochemical staining for CD24-positive Telocytes in renal cortical section (×400)

特洛细胞聚集在肾髓质中，通过对CD34阳性表达，表现出不同形态的胞体，同时telopodes对CD34阳性表达;周围细胞核经过苏木素染色后呈蓝色

Telocytes are accumulated in medulla renis area,the CD34-positive Telocytes are manifested by different shapes,the telopodes are also positive for CD34;the surrounding cells are counter-stained blue by hematoxylin

图10肾髓质区特洛细胞免疫组织化学CD24+单染(×400)

Fig10Single immunohistochemical staining for CD34-positive Telocytes in renal medulla renis area (×400)

肾脏内的特洛细胞对CD117阴性表达，周围细胞核经苏木素染色后呈蓝色

CD117-negative Telocyes in renal tissue;the surrounding cells are counter-stained blue by hematoxylin

图11肾组织特洛细胞免疫组织化学CD117-单染(×400)

Fig11Single immunohistochemical staining for CD117-negative Telocytes in renal tissue(×400)

特洛细胞有一个很小的胞体，有几个非常长而薄的分支，电镜下细胞体平均大小为(9.39±3.26)μm 。细胞胞体的形状与端足的数目有关，如“梨型”细胞仅有1个端足，“纺锤体”型有2个端足，“三角形”有3个端足等[24]。其细胞内有卵圆形核，没有明显的核仁，异染色质团附着在核包膜上，占胞体的25%。核周细胞质含有多种线粒体、小高尔基体、少数粗糙光滑内质网和细胞骨架元素。线粒体丰富，占细胞总数的2%。小的高尔基体和光滑的内质网小于细胞体积的1%～2%，主要见于细胞的扩张。

本研究主要应用免疫组织化学的生物学指标对ApoE-/-小鼠心脏、肝脏和肾脏组织中的特洛细胞进行定性定位研究，发现特洛细胞在不同组织中存在的形式不同，与相应组织内其他细胞的关系也不同，且同时表现出不同的免疫组织化学指标。在心脏组织，特洛细胞对CD34、CD117和CD28皆为阳性表达且普遍存在于整个心肌内，表明心肌内的特洛细胞即有肌纤维细胞特异性生物标记物CD34的蛋白，推测特洛细胞在心肌内可能参与血管和心肌细胞生理、病理学的变化过程；在肝脏内，特洛细胞对CD34、CD117和PDGFR-α阳性表达，但特洛细胞胞体对PDGFR-α阴性表达，仅Telopodes对PDGFR-α阳性表达。特洛细胞存在于肝脏内的分布密度不同，围绕在毛细肝管上皮细胞周围的特洛细胞数量多，形成可见的网状结构，在肝细胞、肝星形细胞等实质细胞周围特洛细胞数量稀疏，细胞之间也不会出现网状结构的形态改变；在肾脏中，特洛细胞免疫组织化学生物标记特性较为单一，对CD34阳性表达，但对CD117和PDGFR-α阴性表达，而且发现特洛细胞在不同肾脏结构中分布也存在明显差异，由于肾脏内不同结构具有相应的不同的功能单位，对机体的内环境调节过程中起到的作用也不同，特洛细胞同时也因组织不同而表现差异，推测特洛细胞在调节不同功能细胞的过程中承担不同的角色。

综上，特洛细胞存在于ApoE-/-小鼠的心脏、肝脏和肾脏内，在特定的区域内形成明显的网状结构，且因不同的组织结构表达不同的生物免疫学指标。由于本研究重点在于应用不同的免疫组织化学方法对特洛细胞进行研究，因生物标记物的不全面而难以全面地推测特洛细胞可能存在的功能，在接下来的研究中，需要增加免疫荧光、蛋白组学和光学透视电镜，甚至基因测序等不同实验方法综合性地对特洛细胞进行研究，明确其在特殊实验动物体内真正的调节功能。