王彦玲 黄琳燕

摘 要：蛋白质的醋酸纤维薄膜电泳分离速度快，对样品吸附少，分离条带清晰，灵敏度高，样品用量少，是本科实验教学中的基础性实验项目，然而在实践过程中发现诸多问题，本文从电泳液、漂洗液及实验各环节细节方面进行优化改进，取得了良好的实验效果。

关键词：醋酸纤维薄膜;硼酸缓冲液;蛋白质电泳;实验教学

中图分类号：Q5-33 文献标识码：A 文章编号：1671-2064（2019）22-0201-02

蛋白质的醋酸纤维薄膜电泳是以醋酸纤维薄膜为介质进行的蛋白质电泳分离实验，由于其分离速度快，对样品吸附少，染色后背景能完全脱色，灵敏度高，样品用量少，操作简单等特点，是临床医学检验中常用的蛋白质检测手段[1]，也是本科实验教学中开展的基础性实验项目[2]。在过去的实验教学中，通常以PH8.4的巴比妥缓冲液为电泳液，以人血清为样本进行电泳分离，电泳后以氨基黑染液进行染色固定，漂洗至背景无色后吸干水分观察结果。人血清电泳后在薄膜上可形成5条清晰的区带，从正极到负极依次为白蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白和γ球蛋白[3]。然而，在多年的实践过程中发现，巴比妥缓冲液在配制时较难溶解，常需加热1-2小时方可溶解完全，且在电泳过程中容易有溶质析出，电泳效果不理想。同时配制缓冲液所需的巴比妥和巴比妥钠均为麻醉镇静药物，近年来国家对毒麻药品的管制日趋严格，在试剂采购和学生实验的安全性方面有诸多限制[4]。另外，在染色液和漂洗液的配方中含有大量甲醇，甲醇有毒且易挥发，存在较大安全隐患。在实验过程中，由于学生对细节把握不好，常出现学生正反面错点、错放，点样时条带过干或过湿，点样区接触滤纸桥，样品太多、太少等问题，导致电泳效果不理想。针对以上问题，本文从电泳液、漂洗液及实验各环节细节方面进行优化改进，取得了良好的实验效果。

1 仪器、试剂及材料

1.1 仪器

DYY-8C型电泳仪（北京六一仪器厂），DYCP-38A型卧式水平电泳槽（北京六一仪器厂）。

1.2 试剂

0.06mol/L PH 8.4的巴比妥缓冲液：称取巴比妥钠10.3g、巴比妥1.84g，加蒸馏水溶解，定容至1000ml。

0.2mol/L PH 8.4的硼酸盐缓冲液：称取硼砂8.58g，硼酸6.8g，加蒸馏水溶解定容至1000ml。

染色液：氨基黑10B 0.5g，溶于冰醋酸10ml、无水乙醇50ml、水40ml的混合液中，于试剂瓶中保存备用。

漂洗液：无水乙醇45ml，蒸馏水50ml，冰醋酸5ml，混匀后于试剂瓶中保存备用。

1.3 材料

健康人血清，2cmx8cm醋酸纤维薄膜（路桥四甲生化塑料厂），自制点样器，镊子等。

2 实验过程

制作滤纸桥，注入电泳液→浸泡薄膜→点样→电泳→染色→漂洗→观察结果，拍照。

3 实验方法的优化改进

3.1 实验前的准备

电泳槽两侧液面要保持在同一水平线;滤纸桥制作时要卡紧，防止突出太多沾到条带上的样品，影响实验效果。滤纸桥要湿透，而中间的平台上要保持干燥，不要存有液体，防止电泳时薄膜中间沾到电泳液，使薄膜湿度不均，影响实验效果。薄膜拿到后先分辨出无光泽面，在无光泽面右上角用铅笔标记学号后两位，在后续点样和观察结果时始终保持标记在右上角，便于分辨正反面和点样端。注意不要用记号笔做标记，否则在后续染色和漂洗过程中标记会脱色消失。

3.2 点样

点样前将薄膜从缓冲液中捞出，用吸水纸吸去多余的水分，注意不要过分吸干，要保持薄膜湿润状态（无白点，白斑）;也不要过湿，否则样品容易弥散，条带不成型。实验人数较多时，不要将薄膜一次全部捞出，应按次序轮流操作，轮到自己时，再将自己的薄膜捞出。点样时在平整光滑的平面上点样，无光泽面朝上，即保持所做标记在右上角，样品不要沾太多或太少，沾取样品后，在培养品边缘靠去呈液滴状多余的血清再点样，使得点样后呈均一的一条直线;点样线应平行于薄膜的短边，并与薄膜的短边边缘留有约1.5cm的距离，防止放置薄膜时样品碰到滤纸桥;点样前可先用铅笔在薄膜准备点样位置划一条直线，引导点样;学生可先在滤纸上练习点样，熟悉点样器操作和样品量的控制。

3.3 电泳

点样完成后，及时的将薄膜放置在滤纸桥上，注意点样面朝下，点样端在负极，另一端在正极。放置时，应使薄膜边缘先与湿润的滤纸接触，然后缓缓放置，防止薄膜与滤纸产生气泡。还应提醒学生，注意放置时防止样品沾到滤纸桥。实验课时学生人数较多，点样花费时间长，应要求每个学生放置薄膜后及时将电泳仪盖上盖子，防止先点样的条带在空气中中间部分干燥，薄膜湿润度不均，影响实验效果。全部点样完成后，盖上盖子，使薄膜平衡5-10分钟后再开始电泳。电泳时，巴比妥缓冲液采用160v，40min电泳，硼酸盐缓冲液采用160v，20min电泳。

3.4 染色、漂洗

电泳完成后，将薄膜转移至盛有染色液的培养皿中，注意，薄膜要一条一条的放入，保证两条薄膜间没有无染液的重叠区。染色30s即可进行漂洗。漂洗至背景无色后，擦干表面水分，保持标记在右上角，观察并拍照。

4 实验结果

如图1所示，以巴比妥缓冲液为电泳液得到的薄膜仅可看见2-3条清晰条带（图1a），改为硼酸盐缓冲液电泳后，可得到清晰的5条条带（图1b，f，g）。条件优化前，经常发生点样过多，有液滴，条带形状不好，不容易辨认（图1c）;样品点在光面，薄膜正负极放错，导致无条带（图1d）;点样时薄膜没有擦干多余水分，放置薄膜时样品碰到滤纸桥或者沾到滤纸桥平面上洒落的电泳液导致样品弥散，条带模糊（图1e），条件优化后，得到清晰的条带（图1b，f，g）。

5 讨论

传统的醋酸纤维薄膜电泳通常以0.06mol/L的巴比妥缓冲液进行电泳，染色液以甲醇、醋酸和水的混合物为溶剂，漂洗液中也含有大量甲醇。然而巴比妥类属于管制药品，学生实验也存在一定的安全隐患，而甲醇有毒，且易挥发，学生实验课人数多，接触时间长，易损害学生健康。本文探索了以硼酸盐缓冲液进行电泳，以乙醇替代染色液和漂洗液中的甲醇的实验模式，实验结果证明，和传统的巴比妥缓冲液相比，以硼酸盐缓冲液进行电泳条带分离更清晰，更易辨认，血清蛋白的5条皆可分离，且实验所需时间更短，仅需电泳20min即可得到良好的分离效果;改良后的染色液和漂洗液使用后，条带染色清晰，背景脱色完全。通过实验各环节的优化，实验效果得到了很大改善，可以稳定的分离出清晰的条带，实验的安全性也得到了提高，可供广大开展醋酸纤维薄膜电泳实验教学的机构借鉴。

参考文献

[1] 张龙翔，等编.生化实验方法和技术[M].北京：高等教育出版社，1997.

[2] 王慶松，文朝阳，李宝红，等.医学生物学实验第二课堂教学的探索与实践[J].继续医学教育，2014，28（11）：91-93.

[3] 童红梅，靳彩虹，李多福，等.醋酸纤维薄膜电泳法分离人外周血清蛋白实验技巧探讨[J].卫生职业教育，2012，30（8）：105-106.

[4] 王庆松，马惠苹，刘华.硼酸缓冲液用于醋酸纤维薄膜电泳的分离效果以及在实验教学中的应用[J].继续医学教育，2017，31（8）：65-66.