苏燕妮

（桓仁县农业发展服务中心，辽宁 桓仁 117220）

自19世纪40年代末基因对基因假说的诞生就标志着分子生物学手段在植物抗病性研究中奠定了基础。植物抗病基因反映了植物对特体病原体的识别以及植物能否启动防卫反应的能力，抗病基因编码的产物决定了植物是否能识别特异性的病原菌，同时也在对植物防卫反应基因表达有着直接或间接的影响。植物中存在着抗侵染、抗扩展、预成抗性、诱导抗性、结构抗性、生化抗性、过敏性坏死反应和系统获得性抗性等。在1992年第一个抗病基因（Hml）被分离后，陆续有很多抗病基因被分离。

1 植物抗病基因类型

大多数植物抗病基因可根据其保守结构的不同分为五大类。通过对已经克隆的抗病基因的氨基酸序列比对发现抗病基因之间具有一些共同的结构域，即：核苷酸结合位点（NBS，nucleotide）、富亮氨酸重复（LRR，leucinerichrepeat）、跨膜结构域（T M，transmembranedomain）、丝氨酸-苏氨酸激酶结构（STK， serine/threonine kinases）、亮氨酸拉链（LZ，leucine）、Toll-白介素-1区域等（TIR，tollinterleukin-1 region）。

2 植物抗病基因研究方法

近年来，随着分子生物学的快速发展并且与基因组学的结合使得基因克隆技术不断创新，不断进步，很多种基因克隆方法也在此过程中产生。

2.1 转座子标签技术（Transponson tagging）

转座子标签技术利用转座子这样的一段可以从一个基因座位移动到其它基因座位的特异DNA片段作为探针获得完整基因的技术方法。它很早就已发展成为一个高效率研究功能基因的主要工具之一，此项技术在后来的研究中又陆续得到了很多植物的抗病基因，比如番茄抗叶霉病基因Cf-9、Cf-4、Cf-5；烟草花叶病毒基因N；番茄抗花叶病毒基因Tm-2；亚麻的抗叶锈病基因L6等。

2.2 染色体移步法（Chromosome Walking）

染色体步移技术是一种可以得到与已知基因序列相邻的未知基因序列的方法。根据已公布的基因或已知的分子标记连续步移，获得重要调控基因，例如启动子的克隆及其功能的研究；应用该方法猎取目标植物中某段基因的非保守区域，就能得到一条相对完整的目的基因序列。此项技术适用于大多数基因组序列尚未知晓的生物，如果想得到某个区域两端的DNA序列，染色体步移法是个高效的途径。

2.3 图位克隆法（Map-based cloning）

根据目标基因序列在相应染色体上的位置进行克隆的方法，又称定位克隆法（positional cloning）。经常在基因表达产物未知和没有适宜的相对表型的产物功能信息的情况下应用，该项技术经常与分子标记等相关技术配套使用，随着其他几项技术的日趋成熟，图位克隆法的应用范围越来越广泛。通过与序列数据库以及分子标记方法的结合，人们已经克隆得到了很多抗病基因，以小基因组的模式植物为主，比如番茄抗霜霉病基因Pto。这种方法同样也存在着一定的局限性，在实际中因其构建的克隆群难度较大，提供不了基因功能的相关信息以及精细作图成本太高等问题都限制了该技术的应用范围。

2.4 m RNA差异显示技术（mRNA differetial display）

克隆差异性表达基因的高效率且方便的途径。目前已广泛应用于对比植物差异表达基因和寻找抗病基因中。mRNA差异显示技术具有高效、灵敏度高、操作简单、周期短、可逐步验证等优点，应用该技术可同时比较多个样品基因表达间的差异，对RNA量的要求也不高，操作周期一般在8天左右。随着该项技术的不断改进，mRNA差异显示技术可以在克隆差异基因的基础上用来寻找抗病基因。

2.5 同源序列克隆法

关于抗病基因的研究一直以来都是人们研究的热点，伴着现代分子生物学等相关技术的不断发展和进步，人们应用图位克隆法（Map-based cloning）和转座子标签法（Transposon tagging）克隆出许多有意义的植物抗病基因，这对植物生产以和各个学科的发展具有深远的意义。但是这两种方法都有一定的局限性，只能克隆基因组较小，遗传图谱和物理图谱有高的分辨率的植物基因，而不适用于基因组大，重复序列多，分子标记图谱比较难构建的植物中。而同源序列克隆法是根据抗病基因的表达的蛋白功能保守区设计合适的引物，并扩增目标基因组DNA或者cDNA，从而从植物体中得到一个或几个结构上与抗病基因相关的片段。在R基因库中筛选得到的片段，比对序列的同源性，分析得到的序列与已知R基因是否有联系，进一步得到抗病基因相关序列的目的。该方法的理论依据是虽然抗病基因识别的病原种类有区别，但是抗病基因编码的蛋白质具有同源序列，因此，根据这些同源序列设计引物寻找抗病目的基因是可行的。当然还有很多通过生物信息学方法和高通量测序的方法来寻找植物抗病相关基因，这些方法都会在人们对抗病基因探索的过程中起到至关重要的作用。