罗行炜 孙华润 魏单单 朱莹莹 徐引弟 贺丹丹 刘建华 潘玉善 吴华 苑丽 胡功政

摘要：为探究猪传染性胸膜肺炎放线杆菌（APP）临床分离株对氟苯尼考（FFC）的耐药性及floR基因的流行与分布情况，收集河南、湖北、江西、陕西、湖南、山西、安徽等7个省份合作猪场送检的病死猪肺脏、脾脏、支气管黏液等206份病料样本，从中分离APP并鉴定，采用微量肉汤稀释法测定分离菌株对FFC的敏感性，PCR及测序方法检测floR基因，并用随机引物PCR（AP-PCR）方法分析临床分离菌株之间的同源性。结果表明，成功分离鉴定了APP 28株，分离率为13.59%。4株APP对FFC耐药，耐药率为14.29%;15株携带floR基因，floR检出率为53.57%，高于APP对FFC的耐药率;有11株分离菌floR阳性但对FFC并不耐药。分析RAPD系统树状图发现，28株APP被分为几乎无核苷酸同源性的A和B 2大类、25种RAPD型，其中A类25株，分22种RAPD型，14株携带floR基因，这些菌株间的核苷酸同源性为40%～80%;B类3株，分3种RAPD型，1株携带floR基因。本研究提示APP的floR基因主要以水平方式传播。

关键词：猪传染性胸膜肺炎放线杆菌;PCR;耐药性;floR基因;随机扩增多态性DNA（RAPD）

中图分类号： S852.61文献标志码： A

文章編号：1002-1302（2019）21-0228-04

收稿日期：2018-08-09

基金项目：国家重点研发计划（编号：2016YFD0501304）。

作者简介：罗行炜（1993—），男，河南光山人，硕士研究生，主要从事细菌耐药机制研究。E-mail：1272376863@qq.com。

通信作者：胡功政，教授，博士生导师，主要从事细菌耐药机制研究。E-mail：yaolilab@163.com。

猪传染性胸膜肺炎是一种高度特异性传染性猪呼吸道类疾病，在我国集约化养殖场尤为多见，引起该病发生的病原为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌（APP）。我国自1987年首次发现此病例以来，某些地区已成功分离鉴定出病原菌APP[2-5]，如锦州地区[2]、江苏泰兴[3]、湖北[4]、贵州[5]等。近年，APP临床分离株的耐药现象越来越严重，其中APP对氟苯尼考（FFC）的耐药性也已受到国内外专家学者的关注[5-11]。FFC作为动物专用的酰胺醇类广谱抗生素，对APP的最小抑菌浓度为0.20～1.56 μg/mL，主要用于巴氏杆菌引起的牛呼吸道感染、猪传染性胸膜肺炎、鸡大肠杆菌病等[6]。细菌对FFC等酰胺醇类药物耐药的机理之一在于floR基因的介导，即floR基因编码耐FFC或氯霉素的外排泵蛋白，从而导致这类药物很难进入或不能进入细菌体内发挥作用[12]。

由于菌株分离时间及分离地点的不同，导致不同地域或不同季节的APP分离株对FFC的耐药情况呈现较大差异。本研究对来自河南（焦作、中牟、安阳等）、湖北、江西、陕西、湖南、山西、安徽等7个省份疑似病猪的肺脏、脾脏、支气管等病变组织进行目的菌分离鉴定，测定APP分离株对FFC的敏感性，进一步检测其floR基因的携带情况，并运用随机引物PCR（AP-PCR）技术检测APP的随机扩增多态性DNA（RAPD）图谱，根据聚类结果分析分离株的同源性，为集约化养猪场合理使用FFC及进一步研究APP分离株floR基因的传播机制提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1病料的采集

病料主要来自河南（焦作、中牟、安阳等）、湖北、江西、陕西、湖南、山西、安徽等7个省份地区养猪场的患病猪，取病变的肺脏、脾脏、支气管等组织样品，共206份。

1.1.2标准菌株

APP标准菌株（ATCC27090），购自中国普通微生物菌种保存中心。

1.1.3培养基及相关试剂

培养基：胰蛋白大豆营养琼脂（TSA）、胰蛋白大豆肉汤（TSB）、巧克力色血琼脂平板，均购自北京奥博星生物技术有限责任公司。其中，TSA和TSB均分别加0.01% NAD和5%血清。

新生小牛血清，购自北京索莱宝生物科技有限公司。

相关试剂：2×Taq PCR Master Mix、ddH2O、DSTM2000 DNA Marker，均购自康为世纪（北京）生物科技有限公司;烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）、50×TAE、1×TE（pH值=80），均购自北京索莱宝生物科技有限公司。

各种生化鉴定管（试剂），购自山东青岛海博生物技术有限公司。

1.1.4引物设计与合成

APP的所有血清型中都存在ApxⅣ基因，在GenBank上下载ApxⅣ基因片段序列（登录号：AF021919.1），设计并合成ApxⅣ扩增引物;floR引物参照Bossé等的试验[8];AP-PCR的引物参照Lee等的试验[13]，引物序列见表1，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.1.5药物

氟苯尼考原料（英文简称：FFC;含量：95%），由河南牧翔动物药业有限公司提供，有效期内进行使用。

1.2方法

1.2.1病原菌分离与镜检

在无菌超净操作台中，分别从猪的肺脏、脾脏、支气管等病料组织中取样，划线接种于巧克力色血琼脂平板和TSA平板，37 ℃恒温培养20 h。观察细菌的菌落形态，挑取疑似APP菌落接种于TSB中。经多次接种纯化培养，将已分离纯化的菌株进行革兰染色，在油镜下观察并记录菌体的形态特征。

1.2.2分离菌株的生化试验鉴定

将纯化后的细菌纯培养物接种于含0.01% NAD和5%血清的生化鉴定管中，然后置于37 ℃、10% CO2培养箱中培养24 h，观察并记录生化反应结果。

1.2.3分离菌株的PCR鉴定

挑取纯化后的单菌落，于TSB中接种，气浴恒温摇床进行37 ℃培养20～24 h后，菌液PCR鉴定。PCR反应体系：2×PCR Taq Master Mix12.5 μL，ApxⅣ上、下游引物各1.0 μL，模板DNA 3.0 μL，ddH2O7.5 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s，56.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环;72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。分别以TSB和标准菌株ATCC 27090为阴性或阳性对照。经1%琼脂糖凝胶电泳后，阳性PCR产物回收，送至上海生工生物工程技术服务有限公司测序，测序结果在NCBI网站上进行BLAST进行比对。

1.2.4药物储备液配制

采用分析天平精确称取适量FFC，再采用高压后的去离子水（适量添加助溶剂N，N二甲基亚酰胺及乙醇）配制初始浓度为5 120 μg/mL的储备母液，置于4 ℃ 冰箱保存备用。

1.2.5药敏试验

参照临床与实验室标准协会（CLSI）执行标准，采用微量肉汤稀释法测定FFC对分离菌株的最小抑菌浓度（MIC）[14]，按照CLSI标准判读并计算MIC50、MIC90和耐药率。以标准菌株ATCC 27090为质控菌。

1.2.6细菌基因组DNA的制备

将APP菌株接种于TSB中，37 ℃培养10～12 h，离心收集菌体后用300 μL 1×TE（pH值=8.0）缓冲液重悬菌体，煮沸10 min，4 ℃、12 000 r/min 离心5 min，上清即为细菌基因组，用1.5 mL Eppendorf管收集，-20 ℃储存。

1.2.7floR基因检测

以APP分离株基因组DNA为模板，设计相关引物（表1）进行PCR检测，反应体系：2×PCR Taq Master Mix 10 μL，floR基因上、下游引物各1 μL，ddH2O6 μL，菌株DNA 2 μL。反应条件：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s，63.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30个循环;72 ℃ 终延伸10 min;4 ℃保存。1%琼脂糖凝胶电泳后，阳性PCR产物回收并送至上海生工生物工程技术服务有限公司测序，测序结果在NCBI网站上进行BLAST比对。

1.2.8随机引物PCR（AP-PCR）

APP分离株的RAPD图谱是运用AP-PCR技术确定的，以提取DNA作为模板，设计引物AP进行PCR扩增。AP-PCR的反应体系：2×PCR Taq Master Mix 10 μL，引物1 μL，菌株DNA 2 μL，ddH2O补至20 μL。反应条件：94 ℃预变性3 min;94 ℃变性1 min，50 ℃ 退火1 min，72 ℃延伸2 min，共40个循环;72 ℃终延伸10 min;4 ℃保存。扩增产物用1.8%琼脂糖凝胶电泳，并用生物电泳凝胶成像系统生成电泳图后，再用GelComparⅡ 6.6软件对此随机引物扩增出的各菌株DNA条带进行整合，建立系统进化树状图。根据聚类结果，以APP的相似性系数进行分型，大于80%的判定为同一种RAPD型，小于80%的判定为不同的型[15]，见表1。

2结果与分析

2.1细菌的分离鉴定

2.1.1分离菌株的培养特性

分离菌株经37 ℃恒温箱中培养18～20 h后，在巧克力色血琼脂平板上菌落为浊白色、圆形隆起，直径大小为1～2 mm，在TSA平板上菌落半透明、表面光滑、边缘整齐，菌落直径在1 mm左右（图1），普通琼脂培养基上不生长。

挑取典型菌落进行革兰染色镜检，油镜下可见革兰阴性小球杆菌，菌体较小，多散在杆状，符合APP的形态和染色特征（图2）。

2.1.2分离菌株的生化试验鉴定结果

生化试验鉴定结果显示，分离菌株均可发酵葡萄糖、蔗糖和甘露糖，但不发酵乳糖、阿拉伯糖、甘露醇和麦芽糖。尿酶试验和过氧化氢试验呈阳性，吲哚试验和硫化氢试验呈阴性。生化试验结果与文献上报道的APP分离株生化试验结果相吻合。

2.1.3分离菌株的PCR鉴定结果

采用ApxⅣ毒素基因的特异性引物对分离菌株和标准菌株进行PCR扩增，均获得预期长度（442 bp）的特异性条带（图3），测序结果在NCBI中进行BLAST比对，与ApxⅣ毒素基因（GenBank登录号AX002405）的同源率达到99%以上。

2.2药敏试验结果

参照CLSI判定标准[14]，FFC对APP的折点为S≤2;I=4;R≥8（S表示敏感;I表示中介;R表示耐药）。FFC质控APP的允许范围为0.25～1.00 μg/mL，本次制备的药物储备液测试质控菌ATCC27090的MIC<0.5 μg/mL，均符合要求。由表2可知，4株APP对FFC耐药，耐药率为14.29%（4/28），MIC范围介于≤0.5～256.0 μg/mL。

2.3floR基因检测结果

分离鉴定的28株APP有15株携带floR基因，检出率为53.57%（15/28）。由图4可知，目的条带位于510 bp 处，回收目的条带测序并进行BLAST比对，结果发现与GenBank已上传的大肠杆菌floR基因（GenBank登录号：EF429662）同源性高达99%。将floR基因的测序结果整理后上传到GenBank，取得的GenBank序列号为MG920811。

2.4隨机扩增多态性DNA（RAPD）

AP-PCR研究发现，28株APP共被分成A和B 2大类，由图5可见，2类间几乎不存在同源性。来自河南、湖北、江西、陕西、湖南、山西、安徽等7个省份的分离株核苷酸亲缘差异性跨度较大，大部分菌株间的同源性为40%～80%，表明此大多数APP分离株是不同的RAPD型。其中，A类有25株，其中14株携带floR基因，核苷酸同源性达80%以上的菌株有6株，分别为170313-1F9、171103-1P1、171103-2F1、171103-3F3、170313-2F4和1144，该6株可分为3种RAPD型，剩下19株每株各1个RAPD型，共22种型;B类有3株，共3种RAPD型，有1株携带floR基因。A和B 2大类28株APP共被分为25种RAPD型。

3討论

APP是猪传染性胸膜肺炎的特异病原菌，其可与其他病原菌继发感染此呼吸道疾病，如巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌等，也可继发病毒性疾病，如猪繁殖与呼吸障碍综合征、伪狂犬病毒病等。该病原菌无明确的选择性培养基，所以在分离鉴定时很难除去杂菌，纯化难度大，导致此菌不能或很难分离[16]。APP对培养基和培养条件要求特殊，且生长缓慢，菌落含菌量少。若应用枪尖法（采用移液枪枪尖直接沾取少量细菌固体培养物于PCR管中，加PCR试剂进行反应）不利于PCR扩增。根据PCP流行病学特点，本研究主要于3—4月及9—12月集中分离病原菌并从206份病料（患猪肺脏、脾脏、支气管等）中成功分离鉴定出28株APP。鉴定关键是充分运用菌液PCR检测技术，来源于Schaller等根据ApxⅣ基因设计引物建立的方法[1]。

近年，国内集约化养殖场对抗生素的需求量越来越大，甚至长期使用抗生素治疗、控制养殖场的患病猪。临床上，细菌对抗菌药不敏感的现象屡见不鲜，甚至出现高强度耐药或多重耐药，包括APP对FFC耐药，如车勇良等分离鉴定的APP对FFC出现耐药现象[17]等。APP对FFC的耐药性还可能与地域有关，例如Kucerova等从分离的APP中检测出对FFC耐药率为0.8%，并从所有耐FFC的菌株中均检测出floR基因[7]。王涛等报道其在苏北地区分离鉴定的3株APP对FFC高度敏感[18]。Bossé等从耐FFC的APP中提取质粒（pM3446F）测得序列并表明含有floR基因[8]。张东超等在天津某规模猪场分离鉴定的APP临床株中，测试其药物敏感性试验发现对FFC高度敏感[19]。国外也报道过APP的临床分离株对FFC敏感[9-11]。APP对FFC耐药最根本的原因是菌株体内floR等基因的表达导致其对FFC耐药。

本试验测试分离株APP对FFC的耐药率为14.29%，但floR的检出率（53.57%） 显著高于APP对FFC的耐药率 这显然说明floR基因在部分APP体内不表达或低表达，因此导致其对FFC不能耐药。FFC作为动物专用广谱抗生素，本研究表明其对多数APP的抗菌活性较高，在临床对治疗APP感染仍有较高的应用价值。floR基因在国外APP中有研究报道[20-21]，但在国内APP分离株中尚未见有检出的报道，而本研究在国内首次检测出floR基因，floR基因在APP中的检出应引起重视。

目前，细菌基因分型的方法主要包括随机扩增多态性DNA（RAPD）、脉冲场凝胶电泳（PFGE）、多位点序列分型（MLST）、肠杆菌基因间重复序列PCR（ERIC-PCR）和基因外重复回文序列PCR（REP-PCR）等。本研究采用的RAPD分型方法简单易行，是由Williams等在PCR技术的基础上首创的1种基因分型方法，运用随机引物扩增以寻找多态性DNA片段，其扩增周期短且无放射性，可用肉眼观察[22]。RAPD的条带越相近，说明其核苷酸的同源性越高，亲缘性越近，为克隆传播。采用GelComparⅡ6.6软件生成进化树状图，发现此分离株共被分成几乎不存在同源性的两大类（A和B类）。A类被分为22种型，B类被分为3种型，共25种RAPD型。携带floR基因的菌株大多集中在A类，且含floR基因的菌株核苷酸同源性多在40%～80%间，表明来自不同省份分离株的核苷酸同源性差异较大，含有floR基因菌株间的核苷酸的同源性较低，说明携带floR基因的APP临床分离株之间的遗传关系较远，多数来自不同的克隆，floR基因在试验菌株间主要是以水平方式传播。

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