金艳猕猴桃组织培养适宜条件筛选

2019-01-03吴燕燕章辰飞吴志勇吴月燕

江苏农业科学 2019年21期

吴燕燕章辰飞吴志勇吴月燕

摘要：以金艳猕猴桃嫩叶、茎段作为外植体材料，研究不同消毒体系灭菌效果及不同激素组合对愈伤组织、不定芽、生根等诱导的影响。结果表明，叶片消毒相对最优方法为70%乙醇30 s+0.1% HgCl2 3 min，茎段消毒相对最优方法为70%乙醇30 s+0.1% HgCl2 4 min;茎段比叶片更容易染菌，而叶片比茎段更容易褐化;愈伤组织诱导时，叶片最优激素组合为6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L，茎段为6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L;不定芽诱导最优激素组合为6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L，在此条件下不定芽长势较快，含单芽或多芽，有少量愈伤组织;最适生根培养基为1/2MS+IBA 0.8 mg/L，生根率达到87.78%，植株生长健壮，根密、多。

关键词：金艳;猕猴桃;组织培养;激素;愈伤组织;嫩叶;茎段

中图分类号： S663.404+.3文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2019）21-0111-04

收稿日期：2018-08-22

基金项目：浙江省一流学科（A）生物工程创新（编号：CX2017013）。

作者简介：吴燕燕（1993—），女，浙江杭州人，硕士，从事植物生理生化研究。E-mail：935986197@qq.com。

通信作者：吴月燕，硕士，从事遗传育种研究。E-mail：wyynb2009@163.com。

在猕猴桃快繁技术体系建立中，通常是以叶片、叶柄、茎尖、茎段、种子等作为外植体进行研究的[1-6]，而不同外植體材料对愈伤组织、不定芽的诱导能力有很大差别，如甘丽萍等研究指出，嫩茎是诱导愈伤组织最好的外植体[7]。对同一种外植体而言，不同放置方式也会影响快繁效果，有研究表明，叶片上表面朝下的愈伤组织诱导率较高，茎段横放比竖放诱导效果好[8]。同时，在组织培养过程中，不同生长调节剂（激素）会发挥不同的作用，生长素、细胞分裂素在组织培养中对组织生长起着非常关键的作用。另外，碳源种类、浓度等也会影响组织培养快繁效果，有研究表明，低浓度碳源不能很好诱导芽的分化形成，而过高浓度碳源虽可促进芽分化，但抑制苗的生长[9]。

金艳是中国科学院武汉植物园以“毛花”猕猴桃为母本，“中华”猕猴桃为父本杂交培育出的猕猴桃新品种[10]，具有丰产、稳产、可溶性固形物含量高、果实极耐贮藏、糖酸比高等优良特性[10-11]，目前鲜见对金艳猕猴桃组织培养快繁的研究报道。本试验以金艳猕猴桃茎段、叶片为外植体，设计不同激素浓度及配比，以筛选出适宜金艳猕猴桃组织培养快繁的条件，为金艳猕猴桃的快速推广应用奠定基础。

1材料与方法

1.1材料选择

2017年4—5月，于浙江省宁波市北仑区北仑芳野瓜果有限公司猕猴桃基地采取金艳猕猴桃带有嫩叶的新梢茎段，冰箱中4 ℃冷藏。

1.2不同消毒剂及消毒时间对金艳猕猴桃外植体的灭菌效果

将采集的金艳猕猴桃带叶茎段，去烂叶烂头，用洗洁精清洗1次，再用流水冲洗30 min;分别取3～6 cm的茎段、5～30 cm2 的嫩叶，分别以70%乙醇、0.1%氯化汞（HgCl2）处理不同时间进行灭菌消毒;无菌水清洗4～5次，滤干，用无菌纸吸干茎段或嫩叶表面水分;切取茎段长约1 cm、叶片约0.5 cm2，并接种到培养基上，定期观察外植体污染、褐化数量及生长情况，统计污染率、褐化率，计算消毒效果[7]。

1.3不同激素组合对愈伤组织、不定芽、生根的诱导情况

1.3.1愈伤组织诱导无菌环境条件下，将经预处理的叶片及茎段分别接种到以MS为基础培养基，分别添加有6-苄氨基嘌呤（6-BA）0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L和萘乙酸（NAA）0.1、0.5 mg/L为组合激素的培养基上，共设置10个处理;接种后20 d调查各处理愈伤组织诱导情况，统计诱导率。

1.3.2不定芽诱导无菌环境条件下，将愈伤组织转接到以MS为基础培养基，分别添加有6-BA 0.5、1.0、1.5 mg/L和NAA 0.1、0.3、0.5 mg/L为组合激素的培养基上，共设置9个处理;接种后20 d调查各处理愈伤组织不定芽诱导情况。

1.3.3生根诱导无菌环境条件下，将诱导形成带有4～5张叶片的不定芽转接到以1/2MS培养基为基础培养基，分别添加吲哚丁酸（IBA）0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mg/L的生根培养基上进行生根培养，接种后30 d调查统计生根情况。

1.4培养条件

诱导培养基中须同时添加蔗糖30 g/L、琼脂7 g/L，pH值调控到在5.7～5.8之间。培养室内培养温度为23～26 ℃，光照度为1 000～1 500 lx，光照时间为16 h/d。

1.5统计分析

采用Excel 2010软件对试验数据进行统计分析。

2结果与分析

2.1不同消毒剂及消毒时间对金艳猕猴桃外植体的灭菌效果

消毒不仅是将外植体表面的微生物去除，同时也是对外植体自生菌的消减，会对外植体本身造成一定影响，而消毒剂种类和消毒时间的不同会影响其对外植体的消毒效果。由表1可知，叶片消毒效果相对最好的方法为70%乙醇30 s+0.1% HgCl2 3 min，此时污染率为12.50%，褐化率为12.50%，消毒效果达到87.50%，茎段消毒效果相对最好的方法为70%乙醇30 s+0.1% HgCl2 4 min，此时污染率为7.50%，褐化率为10.00%，消毒效果达到91.25%;同种消毒剂消毒不同时间，对金艳猕猴桃外植体的效果差异较大，消毒剂为70%乙醇时，不同消毒时间叶片污染率高低为10 s>20 s>30 s，茎段为10 s>20 s=30 s，消毒剂为0.1% HgCl2时，不同消毒时间叶片污染率高低依次为3 min>4 min>5 min，茎段为3 min>4 min=5 min，说明消毒时间越长，外植体灭菌效果相对越好;同一消毒剂消毒相同时间，茎段污染率多高于叶片，说明茎段比叶片更容易染菌，这可能是由于茎段采集时会产生伤口，进而导致茎段更易遭受外生菌和内生菌侵染;消毒剂为70%乙醇时，不同消毒时间叶片褐化率高低依次为20 s=30 s>10 s，茎段为30 s>20 s>10 s，消毒剂为0.1% HgCl2时，不同消毒时间叶片、茎段褐化率高低均依次为5 min>4 min>3 min，说明消毒时间越长，消毒剂对叶片、茎段伤害越大，并主要表现在外植体的切面上;同一消毒剂消毒相同时间，叶片的褐化率多高于茎段，其褐化程度相对更为严重，这一方面可能是由于切取叶片时受到的机械伤害大于茎段，另一方面可能是消毒剂对叶片的毒害作用高于茎段。

2.2不同激素组合对愈伤组织、不定芽、生根诱导的影响

2.2.1对愈伤组织诱导的影响叶片、茎段诱导形成的愈伤组织分别见图1、图2，影响结果见表2。由表2可知，诱导产生叶片愈伤组织的相对最适激素组合为6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L，其诱导率为90.0%，而激素组合6-BA1.5 mg/L+NAA0.5 mg/L 的诱导率相对最低，仅为48.5%;诱导产生茎段愈伤组织的相对最适激素组合为6-BA0.1 mg/L+NAA0.1 mg/L，其诱导率为97.5%，而激素组合6-BA1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L的诱导率相对最低，仅为43.0%;NAA质量浓度一定时，随6-BA质量浓度的增加，叶

片愈伤组织诱导率总体呈先增后降趋势，说明适度低质量浓度6-BA有利于叶片愈伤组织的产生，而高质量浓度6-BA不利于叶片愈伤组织的产生;对茎段而言，NAA质量浓度为0.1 mg/L时，随6-BA质量浓度的增加，茎段愈伤组织诱导率呈逐渐下降趋势，而在NAA质量浓度为0.5 mg/L 时，茎段愈伤组织诱导率呈先下降后上升趋势，NAA 0.5 mg/L+6-BA 1.0 mg/L更不利于茎段诱导产生愈伤组织。

2.2.2对不定芽诱导的影响由表3可知，激素组合6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L时，不定芽分化率相对最高，达到65.00%，不定芽长势较快，含有单芽或多芽，有少量愈伤组织产生; 当NAA质量浓度为0.1 mg/L时，随6-BA质量浓度的增加愈伤组织不定芽分化率呈先增后降趋势当NAA质量浓度分别为0.3、0.5 mg/L时，随6-BA质量浓度的增加，愈伤组织不定芽分化率呈增加趋势，说明高质量浓度6-BA有利于不定芽的分化，而NAA为0.1 mg/L时出现的下降可能是由于6-BA与NAA用量比值过高，抑制了不定芽的产生;6-BA质量浓度一定时，随NAA质量浓度的增加，不定芽分化率呈逐渐下降趋势，高质量浓度NAA抑制愈伤组织分化成不定芽，还对不定芽的生长产生抑制作用。

2.2.3对生根培养的影响图3为不定芽诱导形成的苗，图4为生根的无菌苗，对生根培养的影响结果见表4，由表4可知随IBA浓度的增加不定芽生根率呈先升后降趋势，IBA质量浓度为0.8 mg/L时生根率相对最高，达到87.78%，此时植株生长健壮，根密、多;IBA质量浓度分别为0.5、0.9 mg/L 时，不定芽生根率都低于25.0%，说明IBA质量浓度过低或过高都不利于根的生长。

3结论与讨论

外植体灭菌是植物组织培养中至关重要且必不可少的环节，而消毒剂的选择与使用十分关键。消毒剂种类很多，找到适宜的消毒剂和消毒时间对组织培养可起到事半功倍的作用。于红梅等研究认为，0.1% HgCl2作为消毒剂，其消毒效果明显好于NaClO、H2O2[7]。本试验结果表明叶片最适消毒组合为70%乙醇30 s+0.1% HgCl2 3 min，消毒效果达到87.50%;茎段消毒最适组合为70%乙醇30 s+0.1% HgCl24 min，消毒效果达到91.25%;茎段比叶片更容易染菌，这可能是由于茎段采集时会产生伤口，进而导致茎段更易遭受外生菌和内生菌侵染;叶片比茎段更容易褐化，这可能是由于切取叶片时受到的机械伤害大于茎段或是消毒剂对叶片的毒害作用高于茎段。

生长素是植物愈伤组织诱导中必须使用的物质[12-13]。杜希华等研究指出，培养基中只添加6-BA是无法诱导出愈伤组织的，生长素和细胞分裂素的配合使用有利于愈伤组织的诱导[14]。本试验结果表明，在一定质量浓度范围内，低质量浓度6-BA有利于叶片愈伤组织的产生，而高质量浓度6-BA 不利于叶片愈伤组织的产生;NAA质量浓度为0.1 mg/L 时，随6-BA质量浓度的增加，茎段愈伤组织诱导率呈逐渐下降趋势，而在NAA质量浓度为0.5 mg/L时，茎段愈伤组织诱导率呈先下降后上升趋势，NAA 0.5 mg/L+6-BA 1.0 mg/L更不利于茎段诱导产生愈伤组织，这与吴兴海的研究结果[15]较为吻合。

细胞分裂素对猕猴桃愈伤组织分化和芽分化诱导起关键作用[16]。朱宝成等认为，NAA除能诱导愈伤组织分化外，还能跟6-BA配合使愈伤组织分化出芽和根[17]。杨成行等研究表明，金线莲再生培养体系中，细胞分裂素和生长素配合使用能促进丛生芽的诱导[18]。本试验结果表明，6-BA质量浓度一定时，随NAA质量浓度的增加，不定芽分化率呈逐渐下降趋势，高质量浓度NAA抑制愈伤组织分化成不定芽，还对不定芽的生长产生抑制作用，这可能是由于NAA作为生长素诱导形成愈伤组织的效果要明显优于不定芽，同时也符合生长素与细胞分裂素比值越小则越有利于芽分化，而比值越大则有利于根分化的试验规律;NAA质量浓度为0.1 mg/L时，随6-BA质量浓度的增加，愈伤组织不定芽分化率呈先增后降趋势，这种下降的出现可能与6-BA、NAA比值过高而存在毒副作用，从而抑制不定芽的产生[15]有关。

吴兴海研究指出，使用IBA 0.6 mg/L诱导猕猴桃生根时会产生少量愈傷组织，生根率低，且芽的生长受到抑制[15]。隆前进认为，高质量浓度IBA处理猕猴桃扦插苗可能会有毒害作用而降低其生根率[19]。本试验结果表明，金艳猕猴桃最适生根的IBA质量浓度为0.8 mg/L，其生根诱导率相对最高，达87.78%，而不论是低质量浓度IBA还是更高质量浓度IBA都不利于根的生长;IBA质量浓度为0.9 mg/L时猕猴桃生根率出现骤降，可能与高质量浓度IBA对不定芽产生毒害作用有关。

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