赵涛 王静毅 刘菊华 徐碧玉 金志强

摘要：为发掘出一批香蕉的SNP位点、进一步研究香蕉的遗传关系、相关性状的定位等打下基础，从美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的dbEST数据库下载46 665条香蕉EST序列，经生物信息学方法分析发掘EST-SNP位点，并对其所在核酸序列进行功能注释分析。通过对46 665条EST进行拼接，共得到3 490條重叠群（contigs），在含有4条以上重叠群中发现有39条重叠群中含有SNP位点，从中筛选出127个候选SNP位点，其碱基突变类型中转换、颠换分别占SNP位点总数的63.78%、36.22%。通过序列比对分析发现了34个与香蕉相关基因，证明NCBI中的香蕉EST数据库数据量大，能够发掘出SNP标记对香蕉进行品种鉴定、分类和遗传多样性分析。

关键词：香蕉;EST序列;SNP位点;重叠群;转换;颠换;序列比对分析;遗传多样性

中图分类号： S668.101文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2019）21-0107-04

收稿日期：2018-08-03

基金项目：海南省重点研发计划（编号：ZDYF2018097）;国家自然科学基金（编号：31501043）;国家现代农业产业技术体系建设专项（编号：CARS-31）;中央级公益性科研院所基本科研业务费项目（编号：1630052017018）。

作者简介：赵涛（1990—），男，江苏徐州人，硕士研究生，研究方向为园艺学。Tel：（0898）66890772;E-mail：2532450562@qq.com。

通信作者：金志强，博士，研究员，博士生导师，研究方向为热带果树分子遗传学，E-mail：zhiqiangjin2001@yahoo.com.cn;徐碧玉，博士，研究员，研究方向为热带园艺植物基因工程，E-mail：biyuxu@126.com。

单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）是指在基因组水平上，由单个核苷酸的变异导致等位基因的多态性，不同的等位基因在特定位置上含有不同的碱基对，等位基因频率一般要大于1%。SNP变异类型有转换（transition）、颠换（transversion）、插入（insert）和缺失（deletion）4种，通常只分析颠换和转换。如果一个SNPs的次等位基因频率大于0.1，便可用于关联或者连锁研究。单核苷酸多态性不仅分布在非编码区，在编码区也有分布，存在于编码区的SNP称为cSNP，这为研究者提供了丰富的生物信息。同时，SNP相比SSR具有更高的遗传稳定性。因此，现在人们广泛的将其称为第3代分子标记，同时被认为是应用前景最好的遗传标记[1-3]。

表达序列标签（expressed sequence tags，EST）是来源于功能基因表达的cDNA片段，是转录区域多态性识别的重要资源。随着公共数据库中EST序列的暴发式增长，以EST序列为基础开发分子标记变得越来越方便;同时，EST标记还具有通用性好、信息量大、开发方法简单快捷以及成本低等优点。利用EST开发分子标记可直接用于动植物分子育种等相关领域的研究[4]。

香蕉（Musa acuminata）属于芭蕉科芭蕉属，单子叶草本植物。目前，香蕉已经成为我国热带地区主要农业支柱产业，同时也是世界6亿人口的主食作物[5]，更是世界四大水果之一。然而，近年来环境气候的变化导致我国香蕉主产区经常遭受冷、干旱等逆境胁迫，同时香蕉枯萎病使得香蕉产业正遭受着毁灭性威胁[6]。目前，香蕉主栽品种大多是三倍体，基因组高度复杂，通常状况下都是高度不育的，难以通过传统的杂交育种得到优良品种。现在香蕉育种中如何进行品种鉴定是难点之一。近年来，SNP已广泛应用于品种鉴定和重要性状的基因定位、遗传连锁图谱构建、遗传多样性分析等相关研究领域[7-13]。同时，国内外在香蕉方面进行开发SNP的文章鲜有报道。本研究利用NCBI中的dbEST数据库，通过生物信息学分析开发SNP，以期获得合适的分子标记，为香蕉育种株系鉴定提供技术支持。

1材料与方法

1.1香蕉EST序列的获取

从NCBI网站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）通过关键词“MUSA”搜索下载，共得到46 665条香蕉EST，所有EST序列均以FASTA格式保存。

1.2香蕉SNP的挖掘

利用SeqClean（http：//compbio.dfci.harvard.edu/tgi/software）去除载体序列及冗余序列，之后使用CD-HIT（http：//www.bioinformatics.org/cd-hit）和CAP3（http：//seq.cs.iastate.edu/cap3.html）进行序列的聚类与拼接。利用QualitySNP（http：//www.bioinformatics.nUtools/snpweb/）寻找SNP位点。

1.3筛选原则

香蕉SNP位点筛选原则：（1）规定候选SNP位点两侧至少有5 bp碱基要完全保守;（2）候选SNP位点中的次要等位基因频率至少为30%[14];（3）碱基判读质量与其所在的位置相关，测序所得的序列前区段质量普遍偏低，应选择序列100 bp 以后的候选SNP位点。

1.4BLAST比对

提取含有SNP位点的重叠群（contigs）在NCBI的BLASTn数据库中进行序列比对，提取与序列相似性最高的序列注释信息，对SNP靶向基因产物和物种来源进行分析。

2结果与分析

2.1EST文库来源

由表1可知，香蕉EST文库数量多，但其序列主要来源于14个EST文库，其数量为44 829条，占总EST的96.06%。香蕉EST文库主要来源于香蕉A基因组，在所有的EST文库中，来源于香蕉叶片组织的高达49.48%，来源于菜花样芽分生组织的占23.72%，来源于香蕉根系的占11.09%，来源于香蕉果实的仅占5.41%。在香蕉EST文库中源于Cachaco品种的最多，高达23.72%，其次为Calcutta 4-AA，占比为2000%，Grande Naine品种占14.05%，Pisang Awak（ABB）Sukari Ndizi（AB）Mpologoma（AAA）占11.77%，Pisang Klutug Wulung（PKW）-BB仅占11.33%，其品种和主要组织来源见表1。

2.2香蕉EST序列SNP频率分析

如表2所示，在GenBank数据库中下载到46 665条香蕉EST序列，通过SeqClean去除序列冗余，得到有效的EST序列46 056条。使用CD-HIT和CAP3进行序列的聚类与拼接，获得3 490条重叠群，为了提高SNP位点的可靠性，本研究所用的重叠群EST条数均大于4，经过QualitySNP软件发掘SNP位点，在456条重叠群中发现39条中含有SNP位点，总计127个SNP位点。39条重叠群的碱基总数为35 743 bp，SNP出现的频率为0.35%，即平均每281 bp含有1個SNP位点。39条重叠群中平均1条重叠群中含有3.2个SNP位点，含有SNP位点数最多的重叠群有14个位点，具体见表3。

如表4所示，本研究使用的EST序列包含SNP位点碱基转换占比63.78%，颠换占比36.23%，碱基的插入、缺失不统计。在不同重叠群中不同突变类型SNP位点的数量差异较大，其分布密度变化也很大。

2.3SNP位点所在核苷酸序列同源性比对结果分析

提取39个含有SNP位点的重叠群在NCBI的BLASTn数据库中进行比对。本研究发现3个未知蛋白，可能是香蕉特有或尚未被发现的基因（表5），但须进一步验证。其他基因包括1个与抗逆有关的类热休克蛋白，3个与蛋白质降解、DNA损伤修复有关的泛素蛋白，1个CBS（cystathionine-beta-synthase）编码胱硫醚-β-合成酶基因，4个与蛋白质合成相关的核糖体蛋白，1个与信号传导相关的钙调蛋白，1个参与真核翻译起始进程的真核翻译起始因子，1个含LIM结构域的LIM蛋白，1个与DNA结合的组蛋白，1个参与细胞内物质运输和信号转导的ADP-核糖基化因子，1个运输蛋白，1个过氧化物酶基因，1个韧皮部蛋白以及1个磷脂酰肌醇转移蛋白质家族成员等，其具体的SNP位点的比对结果见表5。

3讨论与结论

目前，开发EST-SNP的软件众多，软件的选取以及如何设置参数都是影响试验结果的关键因素。如PolyPhred只能预测某一核苷酸位点上单个碱基的替换，SNPdetector假阳性率和假阴性率均低，novoSNP的假阳性率明显偏高;在具有可靠的参考序列时，SOAPsnp正确率较高;AutoSNP正确率低;QualitySNP预测位点少但正确率高于AutoSNP，且QualitySNP运行速度更快[15];因此，本研究应选取QualitySNP开发SNP。

在EST序列中进行SNP位点开发时，研究者应当注意影响SNP开发质量的各种筛选参数。其中最主要的因素为重叠群的规格（重叠群所包含EST序列的数量）和次要等位基因（等位基因中出现次数较少的碱基）的出现次数。李猛利用QualitySNP软件对葡萄EST序列进行候选SNP位点分析时发现，为了得到高质量的候选SNP位点，重叠群规格应选择拼接EST数量≥4条以上，同时次要等位基因至少出现2次[16]。因为错配仅出现1次的话很可能是由序列差错引起的，而同一碱基位置上发生2次序列差错的概率则很小。因此在规格为4条，主次等位基因出现次数比为1 ∶1，即次要等位基因出现2次的重叠群中开发的候选SNP其可靠度较高。在规格大于4条的重叠群中，也应当尽量保证主次等位基因出现次数比近似为1 ∶1，即在规格为5～6条的重叠群中，次要等位基因应至少出现2次。一般在聚类时为得到高的比对分值，通常须要在1条序列中加入空格，但这样会被误判为插入或缺失，为避免出现这种情况，在处理结果时可以不考虑插入或缺失，而只分析替换类型。

本研究从NCBI中dbEST公共数据库下载46 665条EST序列，共有46 056条EST序列参与拼接，总计拼接成3 490条重叠群，所含EST序列≥4条的重叠群共456条，在39个重叠群中发现SNP位点。同时大于4条以上的重叠群主要由4～7条EST序列拼接而成，最多的1条重叠群也只有13条EST，8条以上EST拼接的重叠群比较少。同时，本研究中重叠群主要长度在800～1 500 bp，长度在1 500 bp以上的较少。一般为了提高SNP的可靠性，用于SNP分析的重叠群至少包含4条以上。

在39条重叠群中筛选出127个候选SNP位点，SNP频率为0.35%，较甘蔗[14]、茶树[17]等其他物种的SNP频率低，可能是由于香蕉是三倍体植物自交高度不育，在生产上主要依靠吸芽和组培苗进行繁殖生产，香蕉无法通过基因交流产生新的基因变化，所以自身遗传差异变化小，SNP位点相比其他植物少。

一般情况下碱基转换的C/T比A/G更常发生。CpG二核苷酸的胞嘧啶（C）在基因组中最易发生突变，其中大多数是甲基化的，可自发地脱去氨基而形成胸腺嘧啶（T），因此转换型变异的SNP约占2/3[17]。在本研究中，香蕉SNP位点碱基变异类型以G/A为主，占33.07%，C/T占30.70%，与甘蔗[14]、栉孔扇贝[18]碱基变异类型相同，与小麦[19]、大麦[20]、辣椒[21]等物种的SNP碱基变异类型不符。转换类型和颠换类型的数量分别占候选SNP位点总数的63.78%和36.22%，转换与颠换比为1.76 ∶1.00，即转换类型的数量明显高于颠换，与檀小辉等的研究结果[14]存在差异。

本研究中，含有SNP位点最多的重叠群Contigs402和Contigs373分别有14、11个SNP位点，其EST构成分别为5、4条，长度分别为852、863 bp。而只含有1个位点的Contigs97、Contigs287的EST组成分别为6、6条，长度分别为766、901 bp。由此看出，香蕉重叠群中EST序列数量与包含的SNP位点数量并无明显规律，这可能与不同物种间SNP位点的分布差异有关。

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