生乳中体细胞数对乳品质量安全的影响研究进展

2018-12-29苏传友李松励屈雪寅周雪巍赵慧芬杜兵耀王加启

食品科学 2018年23期

苏传友，郑楠，李松励*，屈雪寅，周雪巍，赵慧芬，杜兵耀，王加启

（中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，农业农村部奶产品质量安全风险评估实验室（北京），农业农村部奶及奶制品质量监督检验测试中心（北京），动物营养学国家重点实验室，北京 100193）

乳中体细胞数是指每毫升乳中体细胞的个数。农业行业标准NY/T 800—2004《生鲜牛乳中体细胞测定方法》体细胞数的单位用“个/mL”表示[1]。生乳中体细胞主要是白细胞（淋巴细胞、巨噬细胞、多形核嗜中性白细胞），约占99%，还含有少量乳腺组织脱落的上皮细胞，约占1%[2-3]。体细胞数可以指示乳房炎[4]，通常反映生乳质量安全和乳畜健康状况[5]。乳中体细胞数升高，抗生素和致病菌的潜在风险增加[6-7]。另外用高体细胞数生乳加工的奶粉在后续贮存过程中会产生异味[8]。因此，为了保证乳品安全和品质，许多国家对生乳中体细胞数规定了限量，将体细胞数作为生乳检测的一项重要指标。而我国国家标准暂未对生乳中体细胞数规定限量。在我国奶业从安全向优质转型的关键时期，研究生乳中体细胞数限量标准，对进一步提升我国生乳质量和安全具有重要意义。本文从体细胞数和乳品质量与安全的关系、不同国家对生乳体细胞数的限量及影响乳中体细胞数的因素和体细胞数检测方法等方面作了综述。

1 体细胞和乳品质量与安全的关系

1.1 体细胞对牛乳成分的影响

通常体细胞数增加会改变乳成分。史玉东[9]研究了体细胞数与牛乳化学成分的关系，发现乳中体细胞数升高可以显著降低乳糖含量，而钠和氯含量极显著升高。牛乳蛋白质中以α-、β-、κ-酪蛋白等酪蛋白和β-乳球蛋白、α-乳白蛋白等乳清蛋白为主。体细胞数对牛乳中蛋白质影响较大，体细胞数增加会使牛乳中免疫球蛋白，如乳铁蛋白和溶菌酶含量升高[10]，另外牛乳中纤溶酶和纤溶酶原会随牛乳中体细胞数的增加而升高[11]；而酪蛋白及乳白蛋白含量降低[10]。有研究报道高体细胞数牛乳（84.9万个/mL）比低体细胞数牛乳（4.5万个/mL）蛋白和脂肪更容易降解[12]。牛乳体细胞数增加还能降低乳糖含量[13]。体细胞数对牛乳中C16:1脂肪酸单体、C4:0脂肪酸单体等和cis-9,trans-11-共轭亚油酸的含量有极显著影响。同时，随着体细胞数的增加，牛乳中多不饱和脂肪酸的相对含量显著增加。多不饱和脂肪酸含量与牛乳中体细胞数呈极显著正相关关系，而短链脂肪酸含量与体细胞数呈显著的负相关关系[14]。

牛乳体细胞由多种类型细胞组成，会使牛乳中代谢物产生差异。Sundekilde等[15]用核磁共振技术研究了体细胞数对牛乳中代谢物的影响。研究发现，与低体细胞数牛乳相比，高体细胞数牛乳中乳酸、丁酸、异亮氨酸、醋酸、β-羟丁酸含量增加，而延胡索酸和马尿酸盐含量降低。Zhang Lina等[16]研究了高体细胞数对牛乳中蛋白质组的影响，发现体细胞数没有改变牛乳中的蛋白质种类，而是改变了牛乳中不同蛋白质的表达量。与低体细胞数牛乳相比，高体细胞数牛乳上调的蛋白中，大多与免疫相关的如抗菌肽、α-1-微球蛋白、免疫球蛋白G2重链（immunoglobulin heavy constant gamma 2，IGHG2）、间-α-胰蛋白酶抑制剂重链H4（inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H4，ITIH4）、钙结合蛋白S100A8，改变最显著的是抗菌肽4。下调蛋白中，血小板糖蛋白4（glycoprotein IV，GPIV）、嗜乳脂蛋白亚家族1成员（butyrophilin subfamily 1 member，BTN1）A1和周脂素-2（perilipin-2，PLIN2）是与脂质合成和分泌有关的蛋白，ATP结合盒G亚家族成员2（ATP-binding cassette subfamily G member 2，ABCG2）是和牛乳分泌有关的蛋白，乳凝集素涉及细胞凋亡，CD59糖蛋白与免疫系统相关；其中血小板糖蛋白下调近20 倍。

1.2 体细胞数对牛乳风味和货架期的影响

高体细胞数能够降低牛乳风味，缩短货架期。一方面，用高体细胞数的牛乳加工成巴氏杀菌乳后，冷藏过程中脂类分解较快，酸值大幅增加，产生哈喇味，感官品质下降，货架期缩短[12]；另一方面，高体细胞数牛乳中纤溶酶、纤溶酶原、体细胞源蛋白酶浓度高，牛乳蛋白广泛水解，使疏水多肽积累，产生涩味，导致牛乳货架期缩短[17-19]。低体细胞数和高体细胞数生牛乳经巴氏杀菌后，在5 ℃贮存7、14、21 d，高体细胞数牛乳贮存过程中比低体细胞数牛乳酸值增长率高（P＜0.05）；巴氏杀菌乳冷藏21 d期间低体细胞数牛乳和高体细胞数牛乳酪蛋白都有降解，但高体细胞数牛乳酪蛋白/真蛋白下降幅度极显著大于低体细胞牛乳（P＜0.01）；低体细胞数牛乳21 d冷藏后仍然能够保持较高的感官品质，而高体细胞数牛乳表现出明显的感官缺陷，主要包括酸败、苦味和涩味；建议在乳品行业通过关注体细胞数对高品质牛乳生产者给予额外补贴，从而有利于提高液体乳品质[12]。同样有研究报道，与低体细胞数牛乳相比，利用高体细胞数的牛乳加工酸奶同样可以使脂肪分解，黏度和游离脂肪酸含量增加，货架期缩短；用于生产酸奶的原料乳中体细胞数应该不超过40万个/mL，以防止在贮存过程中酸奶黏度的显著变化[20]。此外，牛乳丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量与体细胞数呈极显著正相关关系（P＜0.01），牛乳体细胞数升高可以使MDA含量升高，导致牛乳更容易氧化[21]。通常高体细胞数会导致体细胞中多性核嗜中性白细胞（polymorphonuclear neutrophil，PMN）的比例增加，由于PMN在脂肪降解中起着重要作用，因此高体细胞数牛乳脂肪降解率高[22]。

1.3 体细胞对乳品安全的影响

体细胞数不仅影响乳品质，还与乳品安全密切相关。体细胞数可以指示奶牛乳房炎，是衡量乳房炎的可靠指标。健康奶牛体细胞数通常较低，而乳房炎是导致乳中体细胞数升高的主要原因。乳房炎主要由细菌感染引起，乳中的体细胞数与革兰氏阳性菌、葡萄球菌、链球菌、菌落总数呈正相关关系[6,23-24]。抗生素广泛用于乳房炎的治疗，Gonzalo等[7]对西班牙卡斯蒂利亚地区209 个牧场进行了5 年的调查，发现抗生素超标的乳中，体细胞数显著升高。乳中高的体细胞数意味着高的微生物含量和抗生素残留风险的增加。病原菌及其毒素能够以乳为介质传给消费者。抗生素残留不仅影响发酵乳的加工，更会降低乳制品安全水平。在正常健康状况下，牛乳中体细胞数一般不超过40万个/mL，隐性乳房炎奶牛乳中体细胞数不超过100万个/mL[25]。合理利用体细胞数，及时发现并治疗奶牛的乳房炎和隐性乳房炎有助于提高乳品质量和安全。

2 生乳中体细胞数的限量

2.1 主要国家或地区生乳中体细胞数限量比较

体细胞数是衡量乳畜健康和生乳质量安全的重要指标，为了保障乳品质量和安全，许多国家对生乳中体细胞数规定了限量。本文整理了澳大利亚、加拿大、欧盟、美国等国家和组织对生乳中体细胞数的限量标准（表1）。不同国家和组织对牛乳中体细胞的限量不同，其中澳大利亚规定体细胞数为不超过20万个/mL[26]，加拿大和欧盟规定体细胞数为不超过40万个/mL[27-28]，美国规定不超过75万个/mL[29]。加拿大和美国都对山羊乳体细胞数也规定了限量，均为不超过150万个/mL[27,29]，美国还规定了绵羊乳中体细胞数限量为不超过75万个/mL[29]，澳大利亚对其他动物乳中体细胞的限量为不超过100万个/mL[26]。但GB 19301—2010《食品安全国家标准生乳》[30]暂未对体细胞数规定限量。

表1 不同国家或地区对生乳体细胞数的限量[26-29]Table1 The limitation of somatic cell count set by different countries for raw milk[26-29]万个/mL

2.2 国外对生乳体细胞的监管

美国联邦法规规定，对生乳中体细胞数测定应该在任何连续6 个月内，须接受至少4 次抽检，并且这4次抽检必须在不同的月份进行。若超过体细胞限量，则通知并警告生产者；若连续4 次抽检中有2 次超过限量值，监管机构须通知生产者并予以书面警告，只要连续4 次抽检中依然有2 次超过限量值，这个警告会持续有效[31]。

欧盟No. 853/2004[28]规定生乳中体细胞数测定每个月的样品量不得低于1 批次；如果生乳中体细胞数不达标，食品经营者必须通知相关当局并采取有效的纠正措施。

2.3 中国对体细胞数的限量和要求

2.3.1 地方标准对体细胞数的限量

虽然我国国家标准暂未对乳体细胞数规定限量，但地方标准有对体细胞数规定了限量。T/HLJNY 001—2016《黑龙江省食品安全团体标准生乳》对体细胞数规定了限量，根据体细胞数将生乳分为特级（≤30万个/mL）、一级（＞30万～40万个/mL）和二级（＞40万～50万个/mL）[32]。另外宁夏回族自治区地方标准DB64/T 1263—2016《生鲜牛乳质量分级》也根据体细胞数将生鲜牛乳分为特优品（≤20万个/mL）、优等品（≤40万个/mL）、一等品（≤60万个/mL）和合格品（≤75万个/mL）[33]。

2.3.2 其他关于体细胞数的要求

2000年2月15日，经上海市政府批准，上海市农委会同市质监局、市物价局和市卫生局联合发布了《上海市生鲜牛乳质量管理暂行办法》，该办法规定了上海生鲜乳收购检测涉及的“八项指标”，并将体细胞数纳入了按质论价体系。体细胞计价方式见表2，上海市收购生鲜牛乳时，当体细胞数在40～75万个/mL时，既不奖励也不减价；超过这一范围按规定分别给予提价或减价。经过上海的按质论价后，上海生鲜乳中体细胞数下降明显，从2006年的111.5万个/mL下降到2014年的57.01万个/mL（表3）[34]。另外周振峰等[35]统计了2007—2009年中国16 个省（市、区）的23 351 头奶牛共225 775 份生乳体细胞数测定记录，生乳中体细胞数总体均值为（48±117）万个/mL，其中不超过20万个/mL的占55.1%，不超过50万个/mL的占77.9%，不超过75万个/mL的占85.2%。中国奶业协会团体标准T/DAC 003—2017《学生饮用奶生牛乳》中规定体细胞数应不超过40万个/mL[36]。

表3 2006—2014年上海生鲜乳体细胞数[34]Table3 SSC in raw milk from Shanghai during 2006-2014[34]

由于我国消费者对食品安全和质量的要求越来越高，我国奶产品质量和安全得到显著提高。尤其是2008年三聚氰胺事件后，有关部门加大了对乳品安全的监管力度，近几年奶牛管理水平的提高使牛乳质量得到了进一步提升。此外，为了提高牛乳质量和安全，提高国际竞争力，中国主要乳企对收购牛乳中体细胞数进行了严格的要求，一般的要求是不超过60万个/mL[37]。

3 影响体细胞数的因素

3.1 乳房感染或损伤

乳房炎是引起乳体细胞数增加的重要因素，当细菌感染、组织损伤或其他影响乳房组织的炎症发生时，体细胞数显著增加[38-39]，其中乳房内感染是影响乳中体细胞的主要因素。可以根据对乳房的感染能力将致病菌分为重要微生物和次要微生物两大类，重要微生物如金黄色葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌一旦感染，乳中的体细胞数会大量增加；而次要微生物主要为棒状杆菌、凝固酶阴性葡萄球菌感染。de Haas等[40]以274 个牛场的2万多头奶牛为对象，研究了不同病原菌造成的乳腺感染对牛乳体细胞数变化的影响，研究结果表明，由大肠杆菌感染乳腺引起的乳中体细胞数变化在感染时出现高峰（150～200万个/mL），感染后下降较快；而被金黄色葡萄球菌感染的乳腺，乳中体细胞数高峰值较高（180～220万个/mL），且在感染后较长的一段时间内体细胞数不能恢复到正常水平。乳中体细胞数通常可以指示奶牛乳房炎，体细胞数与乳房炎的关系见表4[25]。

表4 生乳中体细胞数和乳房炎关系[25]Table4 Correlation between SSC and mastitis in raw milk[25]

3.2 胎次、泌乳期

通常随着胎次的增加，奶牛患乳房炎的风险增加，导致体细胞数增加。Gaafar等[41]研究了胎次和泌乳期对牛乳体细胞数的影响，结果发现体细胞数随着胎次的增加显著增加（P＜0.05）；在分娩初期体细胞数较高，在泌乳前两个月随着泌乳期的延长，体细胞数下降，之后随着泌乳期的延长，体细胞数逐渐增加。Mokhtar等[42]报道，随着胎次的增加，牛乳中的体细胞数有增加的趋势。

3.3 季节变化

通常夏季牛乳体细胞数高于冬季节牛乳体细胞数，因为在高温、高湿季节（例如夏季）奶牛暴露病原体增加，更容易引起乳房感染，而在寒冷季节（冬季或春季）乳房感染的机率较小[43-45]。另外热应激条件下可降低中性粒细胞的吞噬作用，使奶牛对乳房内感染的抵抗作用降低[46]。

3.4 管理

乳房洁净度和乳区及挤奶设备和方式都会影响牛乳体细胞数。乳头括约肌和乳腺导管是阻止病原菌进入乳房的主要生理屏障。奶牛乳房、下肢不洁净，可使乳头经常暴露在高密度病原菌环境中，使乳房炎感染几率增加，造成牛奶体细胞数增加[47]。另外正常生理条件下不同乳区体细胞数差异显著（P＜0.05），研究表明在生理条件下通常左前、右后两个乳区体细胞数高于其他两个乳区体细胞数[48]。

挤奶设备和挤奶程序对体细胞数也有显著的影响。随着奶牛养殖规模的扩大和旋转式挤奶厅数量的增加，挤奶后乳头自动化消毒的需求越来越大。与传统喷洒或药浴的养殖场相比，安装自动乳头药浴和反冲装置的牛场奶牛体细胞数显著降低[49]。挤奶间隔和挤奶次数也会影响乳中体细胞数，一般一天挤两次奶时，通常白天上、下午两次挤奶间隔时间短，而下午和第2天上午挤奶时间间隔长，下午乳中体细胞数低于上午样品中体细胞；另外，在挤奶过程中同一头牛先挤出来的牛乳比后挤出的牛乳体细胞数低；在干奶过程中由2 次/d挤奶改为1 次/d或1 次/2 d，牛乳中体细胞数显著升高[50]。

4 体细胞检测方法

乳中体细胞数检测方法可以分为直接法和间接法。直接法主要有显微镜法、荧光光电计数仪法、库尔特计数仪计数法等；间接测定法主要有加利福尼亚细胞测定法（California mastitis test，CMT）、威斯康辛州乳腺炎试验（Wisconsin mastitis test，WMT）、红外热成像法、pH值法等。直接法测出的结果与体细胞数相关性高，测出的结果更准确，而间接法测出的结果相关性稍差[51]。直接测定法通常自动化程度不高，工作量大或测定设备费用较高，不便普遍推广，但检测结果较准；间接测定法虽然具有操作方法较简单、工作量小、成本低等特点，但精度较低[52]。中国农业行业标准NY/T 800—2004《生鲜牛乳中体细胞测定方法》提供了3 种生乳中体细胞数测定的方法，即显微镜法、荧光光电计数细胞仪法和电子粒子计数细胞仪法[1]。

4.1 直接测定法

直接显微镜细胞计数法是牛奶体细胞数检测的标准方法[53]，原理是将测试的生鲜牛乳涂抹在载玻片上成样膜，干燥、染色，显微镜下对细胞核可被亚甲基蓝清晰染色的细胞计数[1]。该方法准确度较高，是校正其他体细胞数方法和仪器准确性的基础[54]。

荧光光电计数细胞仪法的原理是样品在荧光光电计数体细胞仪中与染色-缓冲溶液混合后，由显微镜感应细胞核内DNA染色后产生荧光的染色细胞，转化为电脉冲，经放大记录，直接显示读数。该方法重复性好、操作简单、速度快，较适合测定大量牛奶样品，但仪器价格较贵，且需经常校正[55]。

库尔特计数仪法的原理是向样品中加入甲醛溶液固定体细胞，加入乳化剂电解质混合液，将包含体细胞的脂肪球加热破碎，体细胞经过狭缝，由阻抗增值产生的电压脉冲数记录并读出体细胞数。该方法可以在短时间内直接读出样品中体细胞数，且结果准确，但前处理较复杂[56]。

4.2 间接测定法

CMT法的原理是利用表面活性剂（烷基芳基磺酸、溴甲酚红紫等）和强碱破坏细胞膜，使体细胞释放DNA等核酸物质，进而产生沉淀或形成凝块，根据凝块可估算体细胞数量。该方法只能将体细胞数划分一个大致的范围，无法确定体细胞具体数值[57]。

WMT法是在CMT基础上建立的，原理基础和CMT法类似，所用到的表面活性剂也一样，但结果是测定值而不是估计值，比CMT法精度高[58-59]。

红外热成像法是根据受感染的乳房表面温度和乳中体细胞数存在正相关关系，可用红外热成像仪在对乳房进行热成像，依据温度值和相关关系模型能够估测出体细胞数，但在体细胞数小于40万个/mL时相关性较低，但用于隐形乳房炎的检测较为准确[60-61]。

pH值法是通过牛乳pH值来判断体细胞数，正常情况下牛乳pH值为6.5～6.8，随着体细胞数的增加，pH值可能超过7.0[62]。用溴百里酚蓝为指示剂，根据颜色值的不同可以区分乳房炎的类型或程度。刘文进等[63]建立了体细胞数与pH值的关系（表5）。该方法是一种定性方法，能够较好地判断隐形乳房炎[64]。