桑圣刚，王梦旖，肖 曼，杜冠魁

(海南医学院 基础医学院，海口 571100)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染是一个重大的公共健康问题[1]. HBV是一种部分双链的环状DNA病毒，其负链DNA含有4个开放性阅读框，分别称为为S、C、X及P区，分别编码表面抗原(HBsAg)、核心和分泌型抗原(HBcAg和HBeAg)、X蛋白(HBx)、多聚酶(HBV P)，这些蛋白在HBV的转录调节和DNA循环等环节中发挥重要的作用. 近几年针对这几个编码框做了很多RNA的干扰研究工作. 其中，X区是最小的片段，约465 bp，所编码的HBx蛋白具有反式激活功能，可以反式激活多种细胞及病毒启动子和多种细胞原癌基因启动子，因此在病毒复制和肝癌的形成中起着重要作用. HBV-X蛋白(HBx)是一个多功能调节蛋白，对基因转录、信号传导、蛋白质降解、细胞周期和细胞凋亡等均具调节作用，HBx可能通过这些作用直接或间接调控HBV复制，并可能导致肝细胞癌变. 用小干扰RNA进行基因治疗可能是抑制病毒表达和疾病进展的有效方法，而乙型肝炎病毒X基因(HBx)可能是此治疗的最佳靶点[2].本研究以siRNA干扰技术构建HBx-siRNA的病毒表达，拟构建针对HBx基因短发夹小干扰RNA(Short hairpin RNA, shRNA)的表达质粒，为研究抗HBV的生物治疗提供有力的工具和新的靶点.

1 材料与方法

1.1 质粒、菌株及细胞系

载体pGenesil-3.1[携带红色荧光蛋白(Ds-Red2)]、大肠杆菌株Trans5α和HepG2.2.15细胞系均由本实验室保存.

1.2 主要试剂

Annealing Buffer for DNA Oligos (5×)、限制性内切酶Hind III、BamH I、Sal I，RNA PCR Kit(AMV) Ver.3.0、Trizol、Agarose D-5(TaKaRa)；SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒(生工生物工程公司)；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根公司)；DMEM/HIGH GLUCOSE、Phosphate Buffered Saline (1×)(HyClone公司)；Trypsin EDTA Solution A、Fetal Bovine Serum(BI公司，以色列)；Trizma base、Tryptone、Yeast Extract(OXOID公司，英国)；CCK-8细胞增殖-毒性检测试剂盒(DOJINDO公司，日本)、TransStart Tip Green qPCR SuperMix(全式金)、Accuri C6 flow cytometer (BD公司，美国)；其他化学试剂均为国产分析纯试剂.

1.3 载体构建

根据GenBank中登录的HBxmRNA基因序列(2182117)，同时参照Sergio Carmona的方法[3]U6 shRNA 5.2，

设计序列：

HBV1-A 5′-GATCCGGCACACGTGAAGCGAAGTGGAGTTCAAGACGCTCCACTTCGCTTCACGTGTGCCTTTTTGTCGACA-3′，

HBV1-B：5′-AGCTTGTCGACAAAAAAGGCACACGTGAAGCGAAGTGGAGCGTCTTGAACTCCACTTCGCTTCACGTGTGCCG-3′.

转录模板合成的引物结构：BamH I +Sense+Loop+Antisense+终止信号+SalI +Hind III. 用DEPC水溶解两条shRNA引物，至终浓度为100 μmol/L的储存液，各取10 μL与10 μL DEPC水混匀至50 μmol/L. 95 ℃退火反应体系，取退火产物1 μL与99 mL ddH2O混匀做100倍稀释. 退火处理后的shRNA模板应用于连接反应. 稀释过的退火片段与经过Hind III和BamH I酶切的pGenesil-3.1质粒载体连接，取25 μL过夜的连接产物，转化感受态Trans5α，涂布于含有35 ng/mL卡那霉素的LB固体培养基上，37 ℃恒温培养16 h；挑取单克隆菌落接种于10 mL含35 ng/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37 ℃ 250 r/min的恒温摇床培养14 h，提取质粒，于-20 ℃保存备用.

1.4 细胞的培养及转染

HepG2.2.15细胞复苏，加入2.5 mL完全培养基，充分吹散细胞，吸至25T细胞培养瓶中，37 ℃恒温、5%CO2条件下培养24 h，然后换液. 2～3 d后消化，加入200 μL无血清无双抗培养基重悬细胞，细胞计数后，选择适当比例与质粒混匀(质粒需10 μg)，将混合液加入电转杯，并于4 ℃冰箱放置10 min后将电转杯放入电转仪，参数设置选择为真核模式2个电脉冲、 脉冲时间200 μs、 电压270 V. 电转完成后立即加入15%FBS无双抗培养基，在37 ℃恒温、5%CO2条件下培养24 h后换新鲜的15%FBS无双抗培养基. 24 h后换含有10%FBS与适量浓度G418的培养液继续培养. 转染48 h后用荧光显微镜观察红色荧光蛋白的表达情况，并计算转染率.

1.5 HBx基因mRNA转录水平的检测

采用QRT-PCR法. 转染48 h后的细胞，提取各组细胞的总RNA，逆转录合成cDNA，以cDNA为模板，GAPDH为内参，扩增HBx基因. 根据文献[4]得GAPDH与HBx定量引物序列(表1). 反应条件：94 ℃预变性30 s，94 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，共45个循环.

表1 定量引物序列Tab.1 Quantitative primer sequences

1.6 CCK-8细胞增殖检测

采用CCK-8细胞增殖检测法. 将未转染重组表达载体的HepG2.2.15细胞与已转染重组表达载体的HepG2.2.15细胞分别消化，并用血球计数板计数，使得每孔细胞数在4000个/100 μL左右，每个样5个复孔. 将96孔板在37 ℃恒温、5%CO2条件下培养48 h后每孔加入10 μL CCK-8，于37 ℃恒温箱反应30 min后放入酶标仪在OD450处测定吸光值，测完后放回恒温箱继续反应，之后每30min测定一次吸光值，共测8次.

1.7 细胞凋亡检测

采用流式细胞仪检测. 将未转染重组表达载体的HepG2.2.15细胞与已转染重组表达载体的HepG2.2.15细胞分别消化，操作步骤参考细胞凋亡分析试剂盒说明书. 用500 μL染色缓冲液重悬细胞，一个细胞样品加入5 μLAnnexin V-PE 再加入5 μL7-AAD. 旋涡轻微震荡数秒. 孵育30 min. 加入400 μL染色缓冲液，通过AccuriC6 flow cytometer对细胞凋亡进行检测与分析.

1.8 统计学分析

采用GraphPad Prism5.0软件进行统计学分析，实验数据用均数±标准差(x±s)表示，多样本均数比较采用方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义.

2 结果

2.1 线性化pGenesil-3.1质粒载体获得

根据pGenesil-3.1质粒载体序列，找到在其U6启动子下存在的Hind III和BamH I酶切位点.并且这两个酶切位点有且只有一个，所以利用限制性内切酶Hind III和BamH I进行酶切获取线性化pGenesil-3.1质粒(图1). 由于这两种内切酶所用的反应液不同，所以先用Hind III进行单酶切,回收后再用BamH I进行单酶切,第二次回收产物即为线性化pGenesil-3.1质粒，见图2～5.

图1 pGenesil-3.1质粒载体图谱Fig.1 Map of pGenesil-3.1 plasmid vector

M:DL15000;1：未酶切质粒；2，3：经Hind III单酶切的质粒图2 pGenesil-3.1质粒Hind III单酶切Fig.2 The single digestion of pGenesil-3.1 plasmid Hind III

M1：DL15000；M2： DL15000；1: 回收产物；M3: DL15000图3 质粒经Hind III单酶切后回收鉴定Fig.3 Recovered by single Hind III digestion

M1：DL2000；1：未酶切质粒；2，3：经BamH I单酶切的质粒；M2：DL15000图4 第一次回收产物再经BamH I单酶切Fig.4 Digested with BamH I after first recovered

M1： DL15000；M2：DL15000；1:回收产物；M3:DL15000 图5 第一次回收产物经BamH I单酶切后回收鉴定Fig.5 Identification of the first recovered product after BamH I single digestion.

2.2 重组质粒pGenesil-3.1-HBx-shRNA的表达鉴定

由pGenesil-3.1质粒图谱及序列分析可知，有且只有在1959 bp处含有SalI酶切位点，故在插入的shRNA中,设计了一个SalI酶切位点，经SalI酶切重组载体能生成两个条带，其中一条约500 bp，说明重组表达载体pGenesil-3.1-HBx- shRNA构建成功，见图6.

M1：DL2000；1：对照组；2-6：Sal I酶切；M2：DL15000图6 重组质粒的酶切鉴定Fig.6 Identification of the digested recombinant plasmid vector

2.3 电穿孔转染细胞后荧光显微镜观察

转染72 h后，可在转染组细胞内看见红色荧光，红色荧光蛋白在细胞质及细胞核内均有表达，空白对照组内未见荧光(图7). 利用有限稀释法筛选阳性单克隆细胞，稳定转染了重组表达载体的HepG2.2.15细胞已能达到60%以上. 并进行扩大培养，见图8.

A)普通光；B)荧光 图7 转染72h的HepG2.2.15细胞荧光显微镜观察(10×)Fig.7 Screening of HepG2.2.15 cells after 72h transfection in fluorescence microscopy (10×)

A)普通光；B)荧光 图8 筛选转染后的HepG2.2.15单克隆细胞荧光显微镜观察(20×)Fig.8 Screening of transfected HepG2.2.15 monoclonal cells in fluorescence microscopy (20×)

2.4 HBx基因mRNA的转录水平

QPT-PCR检测结果表明，单克隆培养过后，转染组HBx基因mRNA的转录水平低于空白对照组. 转染的HepG2.2.15细胞与空白组相比下降了28%(P<0.05)(图9).

图9 QRT-PCR检测细胞中HBx基因mRNA的相对表达量Fig.9 Detection of relative expression of HBx mRNA in cells by QRT-PCR

2.5 CCK-8细胞增殖检测

CCK-8细胞增殖检测结果显示，与空白对照组相比. 转染组细胞增殖水平下降了47%(P<0.05)，见图10.

图10 CCK-8细胞增殖检测Fig.10 CCK-8 cell proliferation assay

2.6 细胞凋亡检测

流式细胞仪结果显示，转染质粒sh HBx组细胞较未转染质粒组细胞晚期凋率增加，细胞的凋亡率也明显增加，见图11.

HepG2.2.15 HepG2.2.15-shRNA图11 细胞凋亡检测Fig.11 Detection of cells apoptosis

3 讨论

慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染通常导致肝硬化，肝功能衰竭和肝癌[5]. 全球约计有2.57亿人患有慢性病乙型肝炎(CHB)，每年有超过88万人死于乙型肝炎病毒(HBV)相关的并发症如肝硬化和肝癌(HCC)(WHO报告，2017年7月)[2]. 目前，抗HBV感染的治疗，主要包括α-干扰素、核苷(拉米夫定)和核苷酸(阿德福韦)类似物，但这些药物仅在少数慢性携带者中产生长期反应[6]，因此，需要利用各种新技术新方法继续寻找有效的治疗方法，比如代谢组学[7]、基因组学等.

HBV具有紧凑的基因组，使其非常适合开发基于核酸杂交的抗病毒疗法. 重叠的开放阅读框(ORF)覆盖整个病毒基因组[8]，保守区域可编码一种以上的蛋白质以及病毒复制所需的HBV顺式元件[3].HBx是多功能HBV序列的一个展示.HBx与聚合酶ORF的3′末端重叠，在病毒逆转录期间可以直接复制，调控转录重要的区域(基本核心启动子和负调控元件)，是研究核酸杂交疗法的良好靶标.

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是由20～30个核苷酸互补单链小RNA分子引起的内源序列特异性基因沉默机制[9, 10]，具有多种可编程作用，参与几种生物过程的调节，从而为经典治疗提供了替代选择的视角[11]. 短发卡RNA(short hairpin RNA，shRNA)是一条有互补发卡环的RNA序列，经常被用在RNA干扰沉默靶基因的表达中. 构建的shRNA表达载体可以与 U6 启动子结合，以启动shRNA的表达，并整合进入细胞基因组而被子代细胞所遗传，使基因沉默能够稳定实现. 细胞自身dicer酶可以切割shRNA，将其变成siRNA，随后siRNA结合至RNA诱导的沉默复合物，使之能够与目的mRNA进行识别和配对结合，并将其降解从而达到基因沉默的目的.

已有文献证实HepG2.2.15细胞中有HBx蛋白的表达[12]，本实验以HepG2.2.15细胞为研究对象，参照Patrick Arbuthnot[3]发表的研究成果，利用RNA干扰技术针对HBx的shRNA序列构建pGenesil-3.1-HBx- shRNA重组表达载体. Sergio Carmona等[3]分析了10个有抗病毒功效的PolⅢ U6启动子调控表达的短发夹RNA(shRNA)，发现在转染的肝细胞中以及在可进行HBV复制的鼠流体动力学注射模型中shRNA5和shRNA6可敲低80%～100%的HBV标记物. 因此，根据HBV基因U6 shRNA5.2设计了一条可编码HBx反义RNA的shRNA序列，为方便测量抗HBxshRNA的表达效率，插入编码红色荧光蛋白的基因. 通过Dicer处理较大的dsRNA可形成短干扰RNA(siRNA)双链体[13]，其中一条链可并入RNA诱导的沉默复合物中，靶向作用于互补的细胞RNA并将其降解[14]. 因此选择仅有单一酶切位点的Hind III和BamH I酶的质粒进行切割得到线性化pGenesil-3.1质粒，再与专门设计的HBx特异的shRNA连接，构成了完整的pGenesil-3.1-HBx- shRNA重组表达载体. 将该质粒转到HepG2.2.15细胞中，荧光显微镜观察经克隆化达到稳定转染具有红色荧光的细胞数量达到60%以上，QPT-PCR检测转染组HBx基因水平已明显降低，这表明pGenesil-3.1-HBx- shRNA重组表达载体构建成功.

对转染后的细胞进行增值活力检测，发现较空白组细胞增殖率降低；同时细胞凋亡检测结果表明，转染后细胞凋亡率增加. 有文献报道，HBx基因转染可显著抑制细胞凋亡，促进细胞周期从G1期进展至S期，并阻滞细胞周期进入S期[15]. 且HBx可通过激活EGFR / Akt途径减少细胞凋亡[16].HBx的沉默可特异性地降低Dll4和裂解的Notch1的水平，同时明显降低了Akt和Erk1 / 2的磷酸化水平，使得细胞凋亡增加和细胞周期停滞[17]. 最近的一份报告显示，只有完整的HBx蛋白，而不是具有截短的C末端的蛋白，才能诱导细胞凋亡，这进一步表明COOH末端区域是其促凋亡功能所必需的[18]. 以上研究表明，HBx可以抑制凋亡，而本研究构建HBx沉默质粒后，细胞的凋亡率增加，这进一步证实pGenesil-3.1-HBx- shRNA重组表达载体构建成功. 但是HBx沉默后诱导细胞凋亡增加的具体作用机制尚不明确，根据以上的研究结果，今后将对具体通路变化进一步探究.

乙型肝炎病毒HBx基因的shRNA重组表达载体pGenesil-3.1-HBx- shRNA构建成功，并且明显降低了HepG2.2.15细胞的活性，这为进一步探究HBx对HBV的影响奠定了基础.