牟基伟，张美佳，吴 建

(佳木斯大学附属第一医院耳鼻喉科,黑龙江佳木斯 154003)

喉癌是头颈部常见恶性肿瘤，指发生在喉部的恶性肿瘤，以鳞状细胞癌最为常见，其发生机制目前尚不明确，可能与吸烟、饮酒、大气污染、病毒感染、放射损伤、接触有毒化学物质等相关[1-3]。随着癌基因研究的深入，越来越多的研究发现喉癌发生与凋亡相关基因失活等存在紧密联系，Survivin是近年来新发现的凋亡抑制蛋白家族成分，可以抑制细胞凋亡，调节细胞周期，参与恶性肿瘤发生、发展[4-5]。目前针对喉癌癌组织Survivin基因表达与凋亡相关因子水平研究较少，因此本文选取佳木斯大学附属第一医院2013年1月至2018年1月126例喉癌患者手术切除的癌组织石蜡标本为研究对象，探讨Survivin基因表达水平与bcl-2、p53、caspase-3等凋亡相关因子的关系,现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 材料取自佳木斯大学附属第一医院2013年1月至2018年1月126例喉癌患者手术切除的癌组织石蜡标本，均经病理组织学证实为鳞状细胞癌，所有患者术前均未接受放化疗。其中男77例，女51例，年龄37～69岁，平均(53.54±9.64)岁；肿瘤部位：声门上型53例，声门型43例，声门下型30例；TNM分期：Ⅰ期14例，Ⅱ期38例，Ⅲ期54例，Ⅳ期20例；分化程度：高分化64例，中分化38例，低分化24例；淋巴结转移：颈淋巴结转移阳性30例，颈淋巴结转移阴性96例。另选取100例声带息肉标本，病理证实为炎症或正常黏膜组织。本研究获得黑龙江省佳木斯大学附属第一医院伦理委员会批准。

1.2实验方法 切片常规脱蜡，蒸馏水洗涤2～3次，经微波抗原热修复后，采用免疫组织化学法检测Survivin、bcl-2、p53、caspase-3蛋白表达，用已知阴性组织作为阴性对照，用已知胃癌阳性片作为阳性对照，试剂盒购自上海研卉生物科技有限公司，具体操作步骤严格按照说明书进行。在高倍镜下选取5个视野，计数500个细胞，记录染色细胞百分比，Survivin主要在细胞质中着色，bcl-2主要在细胞质或细胞膜中着色，p53主要在细胞核中着色，caspase-3主要在细胞质中着色，采用Sinicrope改良法判断Survivin、bcl-2、p53、caspase-3蛋白阳性，染色细胞小于5%为阴性，染色细胞大于或等于5%为阳性。染色结果由2名病理科专家进行双盲判定，意见不统一时商讨后达成一致。采用实时荧光定量聚合酶链反应技术检测Survivin、bcl-2、p53、caspase-3表达量，试剂盒由武汉华美生物工程有限公司提供，具体操作步骤严格按照说明书进行。

2 结 果

2.1Survivin基因表达与喉癌患者临床病理特征的关系 126例喉癌癌组织标本中共检出Survivin阳性86例，阳性率为68.3%(86/126)。Survivin阳性组年龄、性别、肿瘤部位与Survivin阴性组比较差异无统计学意义(P>0.05)，TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、中低分化、淋巴结转移患者比例显著高于Survivin阴性组(P<0.05)，见表1。

表1 Survivin基因表达与喉癌患者临床病理特征的关系[n(%)]

续表1 Survivin基因表达与喉癌患者临床病理特征的关系[n(%)]

2.2喉癌癌组织与声带息肉中Survivin、bcl-2、p53、caspase-3阳性率比较 喉癌癌组织Survivin、bcl-2、p53阳性率显著高于声带息肉(P<0.05)，caspase-3阳性率显著低于声带息肉(P<0.05)，见图1、表2。

A：Survivin阳性，染色部位在细胞浆；B:bcl-2阳性，染色部位在细胞浆和细胞膜；C:p53阳性，染色部位在细胞核；D:caspase-3阳性，染色部位在细胞浆

表2 喉癌癌组织与声带息肉中Survivin、bcl-2、p53、caspase-3阳性率比较[n(%)]

2.3喉癌癌组织Survivin基因表达与bcl-2、p53、caspase-3的关系 经Spearson相关性分析，喉癌癌组织Survivin表达与bcl-2、p53表达呈正相关，与caspase-3表达呈负相关，见表3。

2.4喉癌癌组织与声带息肉中Survivin、bcl-2、p53、caspase-3表达量比较 喉癌癌组织Survivin、bcl-2、p53表达量显著高于声带息肉(P<0.05)，caspase-3表达量显著低于声带息肉(P<0.05)，见表4。

2.5喉癌癌组织Survivin表达量与bcl-2、p53、caspase-3的关系 经Spearson相关性分析，喉癌癌组织Survivin表达量与bcl-2、p53呈正相关(r=0.385、0.407，P<0.05)，与caspase-3呈负相关(r=-0.471，P<0.05)。

表3 喉癌癌组织Survivin基因表达与bcl-2、p53、caspase-3的关系(n)

表4 喉癌癌组织与声带息肉中Survivin、bcl-2、p53、caspase-3表达量比较

3 讨 论

肿瘤是一类细胞周期疾病，经历多基因、多步骤突变，细胞呈失控性生长，其中细胞凋亡失衡是肿瘤发生、发展的重要机制[6-7]。凋亡抑制蛋白家族是一类抑制凋亡的调节因子，Survivin是上世纪九十年代末发现的凋亡抑制蛋白家族新成员，定位于人类染色体17q25，由142个氨基酸组成，只表达于肿瘤与胚胎组织，与其他凋亡抑制蛋白家族成员比较，Survivin结构简单，具有其他成员无可比拟的抗凋亡能力。近年来研究显示，在肺癌、喉癌、胃癌、结直肠癌、鼻咽癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤均可发现Survivin过表达，Survivin已成为肿瘤诊断与治疗的新靶点[8-10]。

本研究采用免疫组织化学法检测喉癌癌组织中Survivin基因，Survivin阳性率为68.3%，与以往研究结果相似[11-12]。喉癌癌组织Survivin阳性患者TNM分期、分化程度、淋巴结转移与Survivin阴性患者比较差异有统计学意义(P<0.05)，随着肿瘤进展，Survivin表达增强，抑制异常突变细胞凋亡，使细胞分裂得以继续，加快喉癌发展，增加癌转移风险。细胞凋亡过程受细胞凋亡促进因子与凋亡抑制因子共同影响。Survivin可作为喉癌临床病理指标，对喉癌发生、发展及转移具有一定诊断与预测价值。本研究显示，喉癌组织Survivin、bcl-2、p53阳性率显著高于声带息肉，caspase-3阳性率显著低于声带息肉，提示Survivin及bcl-2、p53、caspase-3等凋亡相关因子与喉癌发生、发展存在一定联系。bcl-2是一种细胞凋亡的拮抗基因，在人体内以二聚体形式发挥作用，可以延长细胞生命周期，使受损细胞对凋亡刺激因素产生耐受性，从而延长细胞寿命[13-14]。本研究显示，喉癌癌组织Survivin表达与bcl-2表达呈正相关，可能由于Survivin基因所在染色体不稳定，导致bcl-2基因转录激活，二者协同发挥抗凋亡效应。p53是一种肿瘤抑制基因，定位与人类染色体p13，由391个氨基酸组成，可以使细胞分裂终止于复制前期与合成期，诱导细胞凋亡，修复DNA损伤[15-16]。自然型p53半衰期短，免疫组织化学难以检出，本研究所检测到的p53为突变型p53。p53发生基因突变时，自然型p53功能丧失活性，促使细胞向恶性转化，并积聚于细胞内，延长半衰期，使免疫组织化学法可以有效检测。本研究显示，喉癌癌组织Survivin表达与p53表达呈正相关，可能与喉癌发生后自然型p53失活相关。caspase-3是细胞凋亡过程中一种重要效应因子，以酶原形式存在，对细胞死亡刺激发生应答而被激活，使多种与细胞周期相关蛋白失活，促使细胞失活[17]。相关研究显示，肿瘤组织内的caspase-3表达量显著低于正常组织[18]。本研究显示，喉癌癌组织Survivin表达与caspase-3表达呈负相关，主要由于Survivin对caspase-3活化形式具有抑制作用，阻止其自然激活，并与caspase-3特异性结合，造成其活性丧失，抑制细胞凋亡。

综上所述，Survivin基因表达与喉癌病情进展存在一定联系，可作为喉癌预后指标。Survivin基因表达与bcl-2、p53表达呈正相关，与caspase-3表达呈负相关，可通过调节凋亡相关因子，促进肿瘤发展。