满洋　刘富康　曲映红

摘 要：以80%乙醇溶液浸提干燥的乌饭树叶，用分光光度法测定提取液中的粗黄酮含量。在单因素试验的基础上，通过正交试验优化了乌饭树叶粗黄酮的提取工艺。结果表明，粗黄酮最佳提取条件为：提取时间2h、提取温度80℃、料液比1∶15，提取率最高达2.79%。抗氧化试验的结果显示乌饭树叶粗黄酮有较高的DPPH自由基清除能力，是一种良好的天然抗氧化剂。

关键词：乌饭树叶；黄酮；提取工艺；抗氧化性

中图分类号 R284.2 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2018）19-0015-03

Study on Extraction and Antioxidant Activity of Crude Flavonoids from Vaccinium bracteatum Thunb. Leaves

Man Yang et al.

（Shanghai Ocean University，National Experimental Teaching Demonstration Center for Food Science and Engineering，Shanghai 201306）

Abstract：In this study，crude flavonoids was extracted from Vaccinium bracteatum Thunb. leaves with 80% ethanol and its content was determined by spectrophotometry. On the basis of single factor experiment，the extraction process of crude flavonoids from Vaccinium bracteatum Thunb. leaves was optimized by orthogonal test. The optimum extraction conditions were as follows：the extraction time was 2h，the extraction temperature was 80℃，the solid-liquid ratio was 1：15，the extraction rate of flavonoids was 2.79%. The result of antioxidant activity experiment showed that the crude flavonoids has high DPPH free radical scavenging capacity.Vaccinium bracteatum Thunb.leaves is a good source of natural antioxidants.

Key words：Vaccinium bracteatum Thunb.leaves；Flavonoids；Extraction technology；Antioxidant activity

乌饭树又名南烛，因江南地区的人们有用其叶蒸乌饭食用的习俗而得名，属杜鹃花科常绿灌木，主要分布于长江以南各省区。药用历史悠久，其叶汁含有天然黑色素，具有松弛血管、改善血液循环的作用，也可以预防动脉硬化、糖尿病等[1]。乌饭树叶提取物主要以黄酮类和多酚类为主，还含有少量的维生素、糖类、蛋白质等其他成分[2]。有资料显示乌饭树叶的黄酮类提取物具有一定的抗氧化作用[3-4]。本文研究了乌饭树叶粗黄酮提取物对DPPH自由基的清除能力，旨在为开发绿色安全的天然抗氧化剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 乌饭树叶：2016年11月购于湖北武汉。试剂：DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼），乙醇，芦丁，抗坏血酸，硝酸铝，亚硝酸钠，氢氧化钠等，所用试剂均为分析纯。仪器：AL204电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；LLJ-306Z粉碎机，江门市贝尔斯顿电器有限公司；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；KQ5200E超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；RE-52AA旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；LGJ-10台式冷冻干燥机，北京松源华兴科技发展有限公司；752N分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 粗黄酮含量的测定 参照王芳和LONDONO[5-6]的方法，并做些许改动。准确称取40mg芦丁，用80%乙醇溶解，定容至50mL容量瓶中。取5个25mL比色管，分别加入0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL芦丁溶液，各管中加入3.0mL80%乙醇溶液和0.5mL5%亚硝酸钠溶液，混匀后静置6min，加入0.5mL10%硝酸铝溶液，混匀后静置6min，再加入4.0mL5%氢氧化钠溶液，混匀后静置15min，用80%乙醇定容，以未加入芦丁标准溶液的1管作空白对照，测定波长510nm处的吸光度。以芦丁浓度为横坐标，吸光度为纵坐標，绘制标准曲线。精确称取10g粉碎并烘干的乌饭树叶，80%乙醇超声浸提，5000r离心5min，将上清液旋转蒸发去除溶剂后，转移至100mL容量瓶中用80%乙醇定容，得到乌饭树叶粗黄酮提取液，按上述方法测定其吸光度，根据标准曲线计算粗黄酮得率。

1.2.2 乌饭树叶粗黄酮提取工艺优化 通过单因素试验分别考察提取时间（1、1.5、2、2.5h）、提取温度（50、60、70、80℃）、料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25）3个因素对乌饭树叶提取物中粗黄酮得率的影响。在单因素试验的基础上，采用L9（33）正交试验，以乌饭树叶提取物中粗黄酮的得率为考察指标，对提取时间、料液比和提取温度3个影响因素进行综合考察，进一步优化乌饭树叶中粗黄酮的提取工艺条件。正交试验设计结果如表1所示。

1.2.3 乌饭树叶提取物抗氧化性测定（DPPH法） 按1.2.2中正交试验获得的最佳提取工艺进行浸提，离心后的上清液减压浓缩后，冷冻干燥获得乌饭树叶粗黄酮提取物。将浓度分别为20mg·L-1，25mg·L-1，30mg·L-1，35mg·L-1，40mg·L-1，45mg·L-1的粗黄酮和Vc系列溶液按照勾明玥和方敏[7-8]的实验方法，测定样品和空白反应混合物在517nm处的吸光度，根据下列公式计算清除率：

K（%）=[1-（A1–A2）/A0]×100

式中，K为样品对DPPH自由基的清除率，A1为DPPH溶液加样品液后的吸光度，A2为样品液在测定波长的吸光度，A0为DPPH溶液不加样品液的吸光度。

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线 经线性回归得出芦丁浓度与吸光度值关系曲线的回归方程为y=0.026x+0.001，R2=0.999。该方法线性关系良好，可以用来测定乌饭树叶提取物中粗黄酮的得率。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 提取时间对粗黄酮得率的影响 由图1可知，从0.5h开始，随提取时间的增加，粗黄酮的得率随之上升，当提取时间达到1.5h时，得率达到最高；继续延长提取时间，粗黄酮的得率反而下降，这可能是由于已溶出的粗黄酮在持续高温条件下遭到破坏所致[9]。

2.2.2 料液比对粗黄酮得率的影响 由图2可以看出，随着溶剂使用量的增加，粗黄酮的得率也随之升高。料液比为1∶20时，粗黄酮的得率达到最高，再增加溶剂量，得率下降。这可能是由于溶剂继续增加时，导致了其他脂溶性物质的增多[10]，不利于粗黄酮的提取。

2.2.3 提取温度对粗黄酮得率的影响 由图3可知，粗黄酮的得率随提取温度的升高而增大。当温度为80℃时，得率达到最大，这可能是由于温度升高，分子运动加快，从而使黄酮的溶解度不断增大；高温条件下细胞膜易破损，有利于粗黄酮从组织细胞转移到提取溶剂中[11]。

2.3 正交试验结果 由单因素试验得到最好的3个水平分别为提取温度：60、70、80℃；提取时间：1、1.5、2h；料液比：1∶15、1∶20、1∶25，按照正交试验设计表进行正交试验，结果如表2所示。由表2可知，最佳的提取工艺为A3B3C1，即提取温度80℃，提取时间2h，料液比1∶15时乌饭树叶提取物中粗黄酮得率最高。通过表2的极差R分析，三者对粗黄酮得率的影响度为A>C>B，即提取温度>料液比>提取时间。

在A3B3C1的最佳提取工艺条件下进行验证试验，结果表明：重复提取3次，粗黄酮得率平均值为（2.79±0.01）%，因此正交试验的结果是准确和稳定的。

2.4 抗氧化性试验结果 由图4可以看出，乌饭树叶粗黄酮对DPPH自由基的清除率随浓度的提高而上升，虽然低于相同浓度Vc对DPPH自由基的清除率，但依然达到了70%以上的较高水平。

3 结论

采用正交试验优化乌饭树叶中粗黄酮的提取工艺，得到最佳的提取条件为提取时间2h、提取温度80℃、料液比1∶15，该条件下粗黄酮的最大得率为2.79%。

乌饭树叶粗黄酮具有较高的DPPH自由基清除率，是一种良好的天然抗氧化剂，值得进一步开发利用。

参考文献

[1]马仲锦.乌饭树果实对眼睛有益[J].食品文摘，1999，12：10.

[2]国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草（第6卷）[M]. 上海：上海科学技术出版社，1998：45-47.

[3]蔡凌云.乌饭树叶总黄酮体外抗氧化活性[J].中成药，2011，33（6）：1054-1057.

[4]王立，姚惠源，陶冠军，等.乌饭树叶中黄酮类色素的抗氧化活性[J].食品与生物技术学报，2006，25（4）：81-84，88..

[5]王芳，乔璐，淡小燕，等.桑叶黄酮的提取及抗氧化研究[J].广东农业科学，2011，38（15）：76-79.

[6]LONDONO J，DE LIMA V R，LARA O，et al. Clean recovery of antioxidant flavonoids from citrus peel：Optimizing an aqueous ultrasound-assisted extraction method[J]. Food Chemistry，2010，119（1）：81-87.

[7]勾明玥，刘梁，张春枝.采用DPPH法测定26种植物的抗氧化活性[J].食品与发酵工业，2010（36）：148.

[8]方敏，王耀峰，宫智勇.15种水果和33种蔬菜的抗氧化活性研究[J].食品科学，2008，29（10）：97.

[9]PENG L X，ZOU L，ZHAO J L，et al. Response surface modeling and optimization of ultrasound-assisted extraction of three flavonoids from tartary buckwheat （Fagopyrum tataricum）[J]. Pharmacognosy Magazine，2013，9（35）：210-215.

[10]扶慶权，侯佩，陈能.响应面法优化芦蒿叶总黄酮的提取工艺[J].食品科学，2013，34（4）：94-98.

[11]KONG K W，ISMAIL A R，TAN S T，et al. Response surface optimization for the extraction of phenolics and flavonoids from a pink guava puree industrial by-product[J]. International Journal of Food Science and Technology，2010，45（8）：1739-1745.

（责编：张宏民）